Резьба 

Регуляция активности ферментов. Медицинская энзимология (биохимия). Уровни регуляции активности ферментов Строение механизм действия и регуляция активности ферментов

Регуляция активности ферментов.

Механизмы активирования.

1) Ковалентная модификация (то-есть меняются ковалентные связи ферментов)

а)частичный протеолиз (на пепсиноген и трипсиноген могут действовать не только соляная кислота и энтерокиназа, но и активные ферменты – пепсин и трипсин соответсвенно, то-есть происходит аутокатализ).

б) фосфорилирование и дефосфорилирование. Фосфорилирование осуществляют протеинкиназы.

2) Достраивание активного центра (чаще это ионы металлов, особенно марганца, но в ряде случаев металл соедигяется с серой, а потом сера легче взаимодействует с активным центром).

3) Аллостерическое активирование. Как правило воздействие происходит на ту субъединицу, где нет активного центра (т есть чаще это характерно для олигомеров), но в этой субъединице есть регуляторный участок, на который может воздействовать какой-нибудь метаболит (к примеру, АДФ), при этом субъединица меняет структуру, изменяя заодно и структуру субъединицы, содержащей активный центр, делая его тем самым более доступным для субстрата. Как правило аллостерическое активирование и ингибирование - ϶ᴛᴏ процессы саморегуляции, когда промежуточные или конечные метаболиты регулируют скорость реакции.

Структурная организация фермента в клетке .

Каждая клеточная структура имеет определœенный набор ферментов, которые позволяет выполнить определœенную функцию. К примеру, митохондрии снабжены ферментами, способными окислять определœенные субстраты и утилизировать полученную в результате этого энергию. Ядра (в них идет синтез ДНК и РНК, которые способны хранить и передавать наследственную информацию) и тоже имеют специфический набор ферментов (РНК – и ДНК – полимеразы и т.д.). Лизосомы (разрушают различные сложные соединœения) тоже имеют соответствующий набор ферментов (гидролазы, лиазы и т.д.).

Все эти наборы ферментов строго структурированы, то-есть встроены, к примеру, в мембрану митохондрий (дыхательная цепь) в определœенном порядке и находятся в комплексе (к примеру, комплекс, обеспечивающий синтез жирных кислот; комплекс, способствующий превращению пировиноградной кислоты) иногда даже говорят об индикаторных (маркерных) ферментах для клеточных структур (сукцинатдегидрогеназа - для митохондрий, РНК – полимераза – для ядра, кислая фосфатаза для лизосом).

В процессе метаболизма активность ферментов постоянно регулируется, то-есть фермент никогда не работает монотонно. Существуют разные пути регуляции активности ферментов:

1) может меняться количество фермента (то-есть либо усиливаться, либо снижаться синтез фермента). Это происходит за счёт изменения экспресии генов.

2) Может меняться химическая модификация фермента (под действием активаторов, ингибиторов, при изменении рН). Это частичный протеолиз, фосфорилирование и дефосфорилирование, сульфирование и т.д.

3) Меняется активность ферментов при действии гормонов (различные механизмы).

4) На активность фермента может влиять сам субстрат или продукт реакции (являясь либо активатором либо ингибитором).

5) В клетках отмечается и явление компартментализациии, то-есть с помощью биологических мембран разграничены ферменты и те субстраты, которые эти ферменты могли бы разрушить, но это не нужно клетке (к примеру, ферменты лизосом-протеиназы, фосфотазы и т.д. отделœены от веществ, расположенных в цитоплазме) Или разделяются с помощью мембран взаимонесовместимые в одно и тоже время метаболические процессы (к примеру, синтез жирных кислот идет в цитоплазме, а распад жирных кислот - митохондриях). Не всœе ферменты подвержены регуляции. Но в цепи ферментативных реакций есть ключевые ферменты, которые и активируются или ингибируются.

Принципы выделœения ферментов .

Для обнаружения ферментов используется их свойство специфичности. Берут определœенный (специфичный) субстрат, подбирают оптимальные условия (рН, температура) и, добавляют фермент, смотрят идет ли реакция, при этом концентрация субстрата уменьшается, образование продукта повышено. Количественная оценка ферментов дается по их активности (поскольку ферменты содержаться в ничтожных количествах), то-есть определяется скорость ферментативной реакции. Активность ферментов определяют при постоянной температуре (25 или 37 градусах по Цельсию), создавая оптимум рН. Пи этом концентрация субстрата должна быть достаточно высокая. В этих условиях скорость реакции напрямую зависит от концентрации фермента \/ = К[F]. За единицу активноости фермента принимается то его минимальное количество, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ в оптимальных условиях вызывает превращение одного мкмоль субстрата за одну минуту.

Удельная активность - ϶ᴛᴏ ферментативная активность, отнесенная на один мг белка. Согласно рекомендациям комиссии Международного биохимического союза по номенклатуре ферментов, предложено для выражения ферментативной активности использовать катал. 1 катал - ϶ᴛᴏ каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью равной один моль в одну секунду.

Регуляция активности ферментов. - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Регуляция активности ферментов." 2017, 2018.

Регуляция активности ферментов. Медицинская энзимология (биохимия)

Способы регуляции активности ферментов:

1. Изменение количества ферментов.

2. Изменение каталитической эффективности фермента.

3. Изменение условий протекания реакции.


Регуляция количества ферментов

Количество молекул фермента в клетке определяется соотношением двух процессов – скоростями синтеза и распада белковой молекулы фермента.


В клетках существуют два типа ферментов:

1. Конститутивные ферменты – являются обязательными компонентами клетки, синтезируются с постоянной скоростью в постоянных количествах.

2. Адаптивные ферменты – их образование зависит от определенных условий. Среди них выделяют индуцируемые и репрессируемые ферменты.


Индуцируемыми, как правило, являются ферменты с катаболической функцией. Их образование может быть вызвано или ускорено субстратом данного фермента. Репрессируемыми обычно бывают ферменты анаболической направленности. Ингибитором (репрессором) синтеза этих ферментов может быть конечный продукт данной ферментативной реакции.


Изменение каталитической эффективности ферментов

Этот тип регуляции может осуществляться по нескольким механизмам.


Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Активаторы разными путями могут повышать ферментативную активность:

1. формируют активный центр фермента;

2. облегчают образование фермент-субстратного комплекса;

3. стабилизируют нативную структуру фермента;

4. защищают функциональные группы активного центра.


Классификация ингибиторов ферментов:

1. Неспецифические.

2. Специфические:

Необратимые

Обратимые:

§ конкурентные

§ неконкурентные.


Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию молекулы фермента – это кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов. Их действие не связано с механизмом ферментативного катализа.


Необратимое ингибирование

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента. В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg 2+), серебра (Ag +) и мышьяка (As 3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению.

Диизопропилфторфосфат (ДФФ) специфически реагирует лишь с одним из многих остатков серина в активном центре фермента. Остаток Сер, способный реагировать с ДФФ, имеет идентичное или очень сходное аминокислотное окружение. Высокая реакционная способность этого остатка по сравнению с другими остатками Сер обусловлена аминокислотными остатками, также входящими в активный центр ферментов.

ДФФ относят к специфическим необратимым ингибитором «сериновых» ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа.

Монойодуксусная кислота, п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков. Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они реагируют с любыми свободными SH-группами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SH-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп фермента в катализе.


Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты

Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин. Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой ОН-группе серина циклооксигеназы.

Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов, которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления.


Обратимое ингибирование

Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определённых условиях легко отделяются от фермента. Обратимые ингибиторы бывают конкурентными и неконкурентными.


Конкурентное ингибирование

К конкурентному ингибированию относят обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим образованию фермент-субстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор – структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется.

Классический пример конкурентного ингибирования – ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой. Малоновая кислота – структурный аналог сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может также взаимодействовать с активным центром сукцинатдегидрогеназы. Однако отщепление двух атомов водорода от малоновой кислоты невозможно; следовательно, скорость реакции снижается.


Лекарственные препараты как конкурентные ингибиторы

Многие лекарственные препараты оказывают своё терапевтическое действие по механизму конкурентного ингибирования. Например, четвертичные аммониевые основания ингибируют ацетилхолинэстеразу, катализирующую реакцию гидролиза ацетилхолина на холин и уксусную кислоту.

При добавлении ингибиторов активность ацетилхолинэстеразы уменьшается, концентрация ацетилхолина (субстрата) увеличивается, что сопровождается усилением проведения нервного импульса. Ингибиторы холинэстеразы используют при лечении мышечных дистрофий. Эффективные антихолинэстеразные препараты – прозерин, эндрофоний и др.


Антиметаболиты как лекарственные препараты

В качестве ингибиторов ферментов по конкурентному механизму в медицинской практике используют вещества, называемые антиметаболитами. Эти соединения, будучи структурными аналогами природных субстратов, вызывают конкурентное ингибирование ферментов, с одной стороны, и, с другой – могут использоваться этими же ферментами в качестве псевдосубстратов, что приводит к синтезу аномальных продуктов. Аномальные продукты не обладают функциональной активностью; в результате наблюдают снижение скорости определённых метаболических путей.

В качестве лекарственных препаратов используют следующие антиметаболиты: сульфаниламидные препараты (аналоги пара-аминобензойной кислоты), применяемые для лечения инфекционных заболеваний, аналоги нуклеотидов для лечения онкологических заболеваний.


Неконкурентное ингибирование

Неконкурентным называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.

Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.


Аллостерическая регуляция

Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется не только количеством молекул субстрата, но и другими веществами, называемыми эффекторами. Участвующие в аллостерической регуляции эффекторы – клеточные метаболиты часто именно того пути, регуляцию которого они осуществляют.

Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические ферменты играют важную роль в метаболизме, так как они чрезвычайно быстро реагируют на малейшие изменения внутреннего состояния клетки.


Аллостерическая регуляция имеет большое значение в следующих ситуациях:

1. при анаболических процессах. Ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяют осуществлять регуляцию синтеза этих соединений;

2. при катаболических процессах. В случае накопления АТФ в клетке происходит ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез энергии. Субстраты при этом расходуются на реакции запасания резервных питательных веществ;

3. для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ – аллостерические эффекторы, действующие как антагонисты;

4. для координации параллельно протекающих и взаимосвязанных метаболических путей (например, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот). Таким образом, конечные продукты одного метаболического пути могут быть аллостерическими эффекторами другого метаболического пути.


Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов:

1. обычно это олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров или имеющие доменное строение;

2. они имеют аллостерический центр, пространственно удалённый от каталитического активного центра;

3. эффекторы присоединяются к ферменту нековалентно в аллостерических (регуляторных) центрах;

4. аллостерические центры, так же, как и каталитические, могут проявлять различную специфичность по отношению к лигандам: она может быть абсолютной и групповой.


Некоторые ферменты имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к активаторам, другие – к ингибиторам;

1. протомер, на котором находится аллостерический центр, - регуляторный протомер, в отличие от каталитического протомера, содержащего активный центр, в котором проходит химическая реакция;

2. аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие аллостерического эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента;

3. регуляция аллостерических ферментов обратима: отсоединение эффектора от регуляторной субъединицы восстанавливает исходную каталитическую активность фермента;

4. аллостерические ферменты катализируют ключевые реакции данного метаболического пути.


Регуляция каталитической активности ферментов белок-белковыми взаимодействиями.

Некоторые ферменты изменяют свою каталитическую активность в результате белок-белковых взаимодействий.


Различают 2 механизма активации ферментов с помощью белок-белковых взаимодействий:

1. активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков;

2. изменение каталитической активности ферментов вследствие ассоциации или диссоциации протомеров фермента.


Регуляция каталитической активности ферментов путём фосфорилирования/дефосфорилирования.

В биологических системах часто встречается механизм регуляции активности ферментов с помощью ковалентной модификации аминокислотных остатков. Быстрый и широко распространённый способ химической модификации ферментов – фосфорилирование/дефосфорилирование. Модификации подвергаются ОН-группы фермента. Фосфорилирование осуществляется ферментами протеинкиназами, а дефосфорилирование – фосфопротеинфосфатазами. Присоединение остатка фосфорной кислоты приводит к изменению конформации активного центра и его каталитической активности. При этом результат может быть двояким: одни ферменты при фосфорилировании активируются, другие, напротив, становятся менее активными.


Регуляция каталитической активности ферментов частичным (ограниченным) протеолизом.

Некоторые ферменты, функционирующие вне клеток (в ЖКТ или в плазме крови), синтезируются в виде неактивных предшественников и активируются только в результате гидролиза одной или нескольких определённых пептидных связей, что приводит к отщеплению части белковой молекулы предшественника. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит конформационная перестройка и формируется активный центр фермента (трипсиноген – трипсин).

Ферменты плазмы крови

По происхождению ферменты плазмы крови можно подразделить на 3 группы.

1. Собственные ферменты плазмы крови (секреторные). Они образуются в печени, но проявляют своё действие в крови. К ним относятся ферменты свертывающей системы крови – протромбин, проакцелерин, проконвертин, а также церулоплазмин, холинэстераза.

2. Экскреторные ферменты – попадают в кровь из различных секретов – дуоденального сока, слюны и т.д. К ним относятся амилаза, липаза.

3. Клеточные ферменты – попадают в кровь при повреждениях или разрушениях клеток или тканей.


Таблица 4.1. Органоспецифические ферменты (изоферменты)

Энзимопатии

В основе многих заболеваний лежат нарушения функционирования ферментов в клетке – энзимопатии. Приобретённые энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, наблюдают при всех болезнях.

При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомно-рецессивному типу. Гетерозиготы, чаще всего, не имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии обычно относят к метаболическим болезням, так как происходит нарушение определённых метаболических путей. При этом развитие заболевания может протекать по одному из ниже перечисленных «сценариев». Рассмотрим условную схему метаболического пути:

Е 1 Е 2 Е 3 Е 4
А → В → С → D → Р

Вещество А в результате последовательных ферментативных реакций превращается в продукт Р. При наследственной недостаточности какого-либо фермента, например фермента Е 3 , возможны разные нарушения метаболических путей:


Нарушение образования конечных продуктов.

Недостаток конечного продукта этого метаболического пути (при отсутствии альтернативных путей синтеза) может приводить к развитию клинических симптомов, характерных для данного заболевания.

Клинические проявления. В качестве примера можно рассмотреть альбинизм. При альбинизме нарушен синтез в меланоцитах пигментов – меланинов. Меланин находится в коже, волосах, радужке, пигментном эпителии сетчатки глаза и влияет на их окраску. При альбинизме наблюдают слабую пигментацию кожи, светлые волосы, красноватый цвет радужки глаза из-за просвечивающих капилляров. Проявление альбинизма связано с недостаточностью фермента тирозингидроксилазы (тирозиназы) – одного из ферментов, катализирующего метаболический путь образования меланинов.


Накопление субстратов-предшественников.

При недостаточности фермента будут накапливаться определенные вещества, а также во многих случаях и предшествующие им соединения. Увеличение субстратов-предшественников дефектного фермента – ведущее звено развития многих заболеваний.

Клинические проявления. Известно заболевание алкаптонурия, при котором нарушено окисление гомогентизиновой кислоты в тканях (гомогентизиновая кислота – промежуточный метаболит катаболизма тирозина). У таких больных наблюдают недостаточность фермента окисления гомогентизиновой кислоты – диоксигеназы гомогентизиновой кислоты, приводящей к развитию заболевания. В результате увеличиваются концентрация гомогентизиновой кислоты и выведение её с мочой. В присутствии кислорода гомогентизиновая кислота превращается в соединение чёрного цвета – алкаптон. Поэтому моча таких больных на воздухе окрашивается в чёрный цвет. Алкаптон также образуется и в биологических жидкостях, оседая в тканях, коже, сухожилиях, суставах. При значительных отложениях алкаптона в суставах нарушается их подвижность.


Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов-предшественников.

Отмечают заболевания, когда одновременно недостаток продукта и накопление исходного субстрата вызывают клинические проявления.

Клинические проявления. Например, у людей с болезнью Гирке (гликогеноз I типа) наблюдают снижение концентрации глюкозы в крови (гипогликемия) в перерывах между приёмами пищи. Это связано с нарушением распада гликогена в печени вследствие дефекта фермента глюкозо-6-фосфатазы. Одновременно у таких людей увеличиваются размеры печени (гепатомегалия) вследствие накопления в ней не используемого гликогена.

Применение ферментов в медицине

Ферментные препараты широко используют в медицине. Ферменты в медицинской практике находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств.

Кроме того, ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.


Энзимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека.


Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

1. при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

2. количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

3. активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;

4. ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

5. существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.


Применение ферментов в качестве лекарственных средств

Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногенности.


Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:

1. заместительная терапия – использование ферментов в случае их недостаточности;

2. элементы комплексной терапии – применение ферментов в сочетании с другой терапией.


Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.).

В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используют при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты стали широко применять при тромбозах и тромбоэмболиях. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.

Фермент гиалуронидазу (лидазу), катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют подкожно и внутримышечно для рассасывания рубцов после ожогов и операций (гиалуроновая кислота образует сшивки в соединительной ткани).

Ферментные препараты используют при онкологических заболеваниях. Аспарагиназа, катализирующая реакцию катаболизма аспарагина, нашла применение для лечения лейкозов.

Предпосылкой антилейкемического действия аспарагиназы послужило обнаружение в лейкозных клетках дефектного фермента аспарагинсинтетазы, катализирующего реакцию синтеза аспарагина.

Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если имеющийся в плазме аспарагин разрушать введением аспарагиназы, то в лейкозных клетках наступит дефицит аспарагина и в результате – нарушение метаболизма клетки и остановка прогрессирования заболевания.

Иммобилизованные ферменты – это ферменты, связанные с твердым носителем или помещенные в полимерную капсулу.


Для иммобилизации ферментов используют два основных подхода:

1. Химическая модификация фермента.

2. Физическая изоляция фермента в инертном материале.


Часто для иммобилизации ферментов используют капсулы из липидов – липосомы, которые легко проходят через мембраны и оказывают необходимые эффекты внутри клетки.


Преимущества иммобилизованных ферментов:

1. Легко отделяются от реакционной среды, что позволяет использовать фермент повторно. Продукт не загрязнен ферментом.

2. Ферментативный процесс можно осуществлять непрерывно.

3. Повышается стабильность фермента.


Иммобилизированные ферменты можно использовать для аналитических и препаративных целей. Существуют несколько типов устройств, где иммобилизированные ферменты применяются в аналитических целях – ферментные электроды, автоматические анализаторы, тест-системы и т.д.


Препаративное использование иммобилизованных ферментов в промышленности:

1. Получение L-аминокислот с помощью аминоацилазы.

2. Получение сиропов с высоким содержанием фруктозы с использованием глюкозоизомеразы.

Ферменты являются регулируемыми катализаторами. В качестве регуляторов могут выступать метаболиты, яды. Различают:

- активаторы – вещества, увеличивающие скорость реакции;

- ингибиторы – вещества, уменьшающие скорость реакции.

Активация ферментов . Различные активаторы могут связываться либо с активным центром фермента, либо вне его. К группе активаторов, влияющих на активный центр, относятся: ионы металла, коферменты, сами субстраты.

Активация с помощью металлов протекает по различным механизмам:

Металл входит в состав каталитического участка активного центра;

Металл с субстратом образуют комплекс;

За счет металла образуется мости между субстратом и активным центром фермента.

Субстраты также являются активаторами. При увеличении концентрации субстрата скорость реакции повышается. по достижению концентрации насыщения субстрата эта скорость не изменяется.

Если активатор связывается вне активного центра фермента, то происходит ковалентная модификация фермента :

1) частичный протеолиз (ограниченный протеолиз). Таким образом активируются ферменты пищеварительного канала: пепсин, трипсин, химотрипсин. Трипсин имеет состояние профермента трипсиногена, состоящего из 229 АК остатков. Под действием фермента энтерокиназы и с добавлением воды он превращается в трипсин, при этом отщепляется гексапептид. Изменяется третичная структура белка, формируется активный центр фермента и он переходит в активную форму.

2) фосфорилирование - дефосфорилирование. Пр.: липаза+АТФ= (протеинкиназа) фосфорилированная липаза+АДФ. Это трансферная реакция, использующая фосфат АТФ. При этом осуществляется перенос группы атомов от одной молекулы к другой. Фосфорилированная липаза является активной формой фермента.



Таким же путем происходит активация фосфорилазы: фосфорилаза B+ 4АТФ= фосфорилаза А+ 4АДФ

Также при связывании активатора вне активного центра происходит диссоциация неактивного комплекса «белок-активный фермент». Например, протеинкиназа – фермент, осуществляющий фосфорилирование (цАМФ-зависимое). Протеинкиназа – это белок, имеющий четвертичную структуру и состоящий из 2-х регуляторный и 2-х каталитических субъединиц. R 2 C 2 +2цАМФ=R 2 цАМФ 2 + 2С. Такой тип регуляции называется аллостерической регуляцией (активацией).

Ингибирование ферментов . Ингибитор – это вещество, вызывающее специфическое снижение активности фермента. Следует различать ингибирование и инактивацию. Инактивация – это, например, денатурация белка в результате действия денатурирующих агентов.

По прочности связывания ингибитора с ферментом ингибиторы делят на обратимые и необратимые.

Необратимые ингибиторы прочно связаны и разрушают функциональные группы молекулы фермента, которые необходимы для проявления его каталитической активности. Все процедуры по очистке белка не влияют на связь ингибитора и фермента. Пр.: действие фосфорорганических соединений на фермент – холинэстеразу. Хлорофос, зарин, зоман и др. фосфорорганические соединения связываются с активным центром холинэстеразы. В результате происходит фосфорилирование каталитических групп активного центра фермента. В следствии молекулы фермента, связанные с ингибитором, не могут связываться с субстратом и наступает тяжелое отравление.

Также выделяют обратимые игнибиторы , например прозерин для холинэстеразы. Обратимое ингибирование зависит от концентрации субстрата и ингибитора и снимается избытком субстрата.

По механизму действия выделяют:

Конкурентное ингибирование;

Неконкурентное ингибирование;

Субстратное ингибирование;

Аллостерическое.

1) Конкурентное (изостерическое) ингибирование – это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием ингибитора с активным центром фермента. При этом ингибитор имеет сходство с субстратом. В процессе происходит конкуренция за активный центр: образуются фермент-субстратные и ингибитор-ферментные комплексы. E+S®ES® EP® E+P; E+I® E. Пр.: сукцинатдегидрогеназная реакция [рис. COOH-CH 2 -CH 2 -COOH®(над стрелкой СДГ, под ФАД®ФАДН 2) COOH-CH=CH-COOH]. Истинным субстратом этой реакции является сукцинат (янтарная к-та). Ингибиторы: малоновая к-та (COOH-CH 2 -COOH) и оксалоацетат (COOH-CO-CH 2 -COOH). [рис. фермента с 3 дырками+ субстрат+ ингибитор= комплекс ингибитора с ферментом]

Пр.: фермент холинэстераза катализирует превращение ацетилхолина в холин: (CH 3) 3 -N-CH 2 -CH 2 -O-CO-CH 3 ® (над стрелкой ХЭ, под – вода) CH 3 СOOH+(CH 3) 3 -N-CH 2 -CH 2 -OH. Конкурентными ингибиторами являются прозерин, севин.

2) Неконкурентное ингибирование – торможение, связанное с влиянием ингибитора на каталитическое превращение, но не на связывание фермента с субстратом. В этом случае ингибитор может связываться и с активным центром (каталитический участок) и вне его.

Присоединение ингибитора вне активного центра приводит к изменению конформации (третичной структуры) белка, вследствие чего изменяется конформация активного центра. Это затрагивает каталитический участок и мешает взаимодействию субстрата с активным центром. При этом ингибитор не имеет сходства с субстратом и это ингибирование нельзя снять избытком субстрата. Возможно образование тройных комплексов фермент-ингибитор-субстрат. Скорость такой реакции не будет максимальной.

К неконкурентным ингибиторам относят:

Цианиды. Они связываются с атомом железа в цитохромоксидазе и в результате этого фермент теряет свою активность, а т.к. это фермент дыхательной цепи, то нарушается дыхание клеток и они гибнут.

Ионы тяжёлых металлов и их органические соединения (Hg, Pb и др.). Механизм их действия связан с соединением их с различными SH-группами. [рис. фермента с SH-группами, иона ртути, субстрата. Все это соединяется в тройной комплекс]

Ряд фармакологических средств, которые должны поражать ферменты злокачественных клеток. Сюда же относятся ингибиторы, использующиеся в сельском хозяйстве, бытовые отравляющие вещества.

3) Субстратное ингибирование – торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата. Происходит в результате образования фермент-субстратного комплекса, неспособного подвергаться каталитическому превращению. Его можно снять и уменьшить концентрацию субстрата. [рис. связывания фермента сразу с 2 субстратами]

4) Аллостерическое ингибирование – торможение ферментативной реакции, вызванное присоединением аллостерического ингибитора в аллостерическом центре аллостерического фермента. Такой тип ингибирования характерен для аллостерических ферментов, имеющих четвертичную структуру. В качестве ингибиторов могут выступать метаболиты, гормоны, ионы металлов, коферменты.

Механизм действия:

а) присоединение ингибитора к аллостерическому центру;

б) изменяется конформация фермента;

в) изменяется конформация активного центра;

г) нарушается комплиментарность активного центра фермента к субстрату;

д) уменьшается число молекул ES;

е) уменьшается скорость ферментативной реакции.

[рис. фермент с 2 дырками, к одной аллостерический ингибитор и вторая меняет форму]

К особенностям аллостерических ферментов относят ингибирование по отрицателтной обратной связи. A®(E 1)B®(E 2) C®(E 3) D (от D стрелочка к стрелке между А и В). D – метаболит, действующий как аллостерический ингибитор на фермент Е 1 .

Обмен веществ

Обмен веществ (метаболизм) – это совокупность физиологических и биохимических процессов, обеспечивающих жизнедеятельность организма во взаимосвязях с внешней средой, направленных на самовоспроизведение и самосохранение.

К физиологическим процессам относятся пищеварение, всасывание, внешнее дыхание, выделение и др.; к биохимическим – химические превращения белков, жиров, углеводов, поступающих в организм в виде пищевых веществ. Особенностью биохимических процессов является то, что они осуществляются в ходе ряда ферментативных реакций. Именно ферменты обеспечивают определенную последовательность, места и скорость реакций.

По направленности все химические превращения делят на:

а) диссимиляция (катаболизм) – распад веществ до более простых с переходом энергии связей вещества в энергию макроэргических связей (АТФ, НАД·Н, др.);

б) ассимиляция (анаболизм) – синтез более сложных веществ из более простых с затратой энергии.

Биологическое значение этих двух процессов состоит в том, что при расщеплении веществ освобождается заключенная в них энергия, которая обеспечивает все функциональные возможности организма. В то же время, при распаде веществ образуются "строительные материалы" (моносахариды, АК, глицерин и др.), которые затем используются в синтезе специфических организму веществ (белков, жиров, углеводов и др.).

[СХЕМА] Над горизонтальной линией (во внешней среде) – "белки, жиры, углеводы", от них стрелка вниз под линию (внутри организма) к надписи "диссимиляция", от последней четыре стрелки: две вверх к надписям над линией "теплота" и "конечные продукты"; одна стрелка вправо к надписи "промежуточные вещества (метаболиты)", от них к "ассимиляция", затем к "собственные белки, жиры, углеводы"; одна стрелка вниз к надписи "энергия АТФ", от нее – к "мышечное сокращение, проведение нервного импульса, секреция и др." а также наверх к "теплота" и "ассимиляция".

Диссимиляция белков, жиров и углеводов протекает по-разному, но в разрушении этих веществ есть ряд общих этапов:

1) Этап переваривания . В ЖКТ белки распадаются до АК, жиры – до глицерина и ВЖК, углеводы – до моносахаридов. Нарабатывается большое количество неспецифических веществ из специфических, поступающих извне. За счет переваривания в ЖКТ выделяется около 1% химической энергии веществ. Этот этап необходим для того, чтобы вещества, поступившие с пищей, смогли всосаться.

2) Этап межуточного обмена (тканевой обмен веществ, метаболизм ). На клеточном уровне он распределяется на анаболизм и катаболизм. Образуются и превращаются промежуточные вещества обмена веществ – метаболиты . При этом мономеры, образовавшиеся на этапе переваривания, распадаются с образованием небольшого (до пяти) ключевых промежуточных продуктов: ЩУК, альфа-КГ, ацетил-КоА, ПВК, альфа-глицерофосфат. Выделяется до 20% энергии веществ. Как правило, межуточный обмен происходит в цитоплазме клеток.

3) Окончательный распад веществ с участием кислорода до конечных продуктов (СО 2 , Н 2 О, азотсодержащие вещества). Выделяется около 80% энергии веществ.

Все рассмотренные этапы отражают лишь главные формы обменных процессов. Как на втором, так и на третьем этапах выделяющаяся энергия накапливается в виде энергии химических связей макроэргических соединений (это вещества, имеющие хотя бы одну макроэргическую связь, напр., АТФ, ЦТФ, ТТФ, ГТФ, УТФ, АДФ, ЦДФ, …, креатинфосфат, 1,3-дифосфоглицериновая кислота). Так, энергия связи последнего фосфата в молекуле АТФ составляет около 10-12 ккал/моль.

Биологическая роль обмена веществ:

1. аккумуляция энергии при распаде химических соединений;

2. использование энергии для синтеза собственных веществ организма;

3. распад обновляемых структурных компонентов клетки;

4. происходит синтез и распад биомолекул специального назначения.

Обмен белков

Организм очень сложная система, и все процессы в нём в норме взаимосвязаны, без лишних реакций и напрасных затрат. Но т.к. организм не закрытая система, и постоянно испытывает воздействия извне, нужны механизмы регуляции, которые бы приспосабливали его к этим изменениям.

Поскольку всеми процессами в нашем организме управляют ферменты (гормоны действуют через фермент), то при изменении условий для соответствия процессов этим условиям будет меняться активность и количество ферментов.

1 уровень. Изменения активности при изменении температуры, кол-ва субстрата, рН среды, т.к. в этих условиях меняется подвижность молекулы, ионизация функциональных групп, а следовательно, и активность фермента.

2 уровень. Влияния активаторов и ингибиторов на работу фермента (его количество не меняется, меняется конформация) через аллостерич. и иногда активный центр.

3 уровень. Индукция и репрессия синтеза Е, т.е. меняется его количество.

4 уровень – организменный (нейрорегуляция). Происходит регуляция синтеза ферментов, участвующих в процессах нормализации гомеостаза. 4.1. гормональная – одни гормоны влияют на выделение других (релизинг-факторы: статины, либерины, а затем - тропные гормоны). 4.2. регуляция продукции гормона по типу обратной связи (почти всегда по отрицательной). 4.3. регуляция с участием структур ЦНС. 4.4. саморегуляция, зависит от параметров гомеостаза.(околощитовидная железа при

снижении Са в крови увеличивает продукцию паратгормона).

Регуляции активности ферментов .

1. Частичный протеолиз - активатор

Из неактивного фермента

образуется активный. пептид

Это обеспечивает появление

активного фермента в нужный момент

и в нужном месте (пищеварительные ферменты; ферменты, участвующие в свёртывании крови).

2. Белок – белковые C R

Взаимодействия в виде C R +4сАМР 2 R 4сАМР + 2 С

присоединения или

отщепления регуляторных неактивн. ПК активная

субъединиц или регуляторов. Происходит связывание с АМР с регуляторн.

субъединицей (R) и тем самым освобождение

каталитической субъединицы, осуществляющей

фосфорилирование белков.

3. Фосфорилирование и

Дефосфорилирование – АТР АДР

основной механизм протеинкиназа

Контроля скорости белок ФП

Протеинфосфатаза

Введение «-» заряженной фосфорной группы приводит к обратимым изменениям конформации, и к изменению активности фермента (гликогенсинтаза, тканевая липаза).

4. Аллостерическая:

*активатор взаимодействует

с аллостерич. центром à

изменяется конформ.à

Улучшение связывания S с Е

и скоростьреакции. фосфофруктокиназа инибируется АТФ


* Ингитор взаимодействует изоцитратДГ игибируется АТФ,

с Е происходит ингибирование +

реакциив результате НАДН Н

Активность ферментов может изменяться под влиянием различных внешних факторов. Вещества, способные оказывать влияние на активность ферментов, обозначают как модуляторы ферментов . В свою очередь модуляторы подразделяют на две группы:

1. Активаторы . Под их влиянием происходит увеличение активности ферментов. В качестве активаторов могут выступать катионы металлов. Например, Na + является активатором амилазы слюнных желез человека.

2. Ингибиторы. Вещества, под влиянием которых происходит уменьшение активности ферментов.

Ингибиторы представляют большую группу веществ, которые различаются по механизму ингибирующего действия.

По продолжительности ингибирующего эффекта ингибиторы подразделяются на:

· необратимые (которые при взаимодействии с ферментом навсегда лишают его ферментативной активности);

· обратимые (которые временно уменьшают активность фермента).

Механизм действия необратимых ингибиторов можно описать следующим уравнением:

In + E EIn ,

где EIn – комплекс фермента с ингибитором, в котором он не обладает каталитическими свойствами.

Как правило, необратимые ингибиторы взаимодействуют с функциональными группами активного центра фермента. Они ковалентно соединяются с ними и, таким образом, блокируют их. В результате этого фермент утрачивает способность взаимодействовать с субстратом.

Классическим примером необратимых ингибиторов являются фосфорорганические вещества. В течение многих лет в качестве такового в биохимических исследованиях используется диизопропилфторфосфат (ДФФ). Фосфорорганические соединения соединяются с остатком серина в активном центре фермента:

К ферментам, которые содержат в активном центре серин, относятся холинэстераза, трипсин, эластаза и др.

В качестве других необратимых ингибиторов широкое применение находят алкилирующие агенты. Эти соединения взаимодействуют с SH-группами цистеина или имидазальными радикалами гистидина в активном центре. Механизм необратимого ингибирования ферментов иодацетамидом:

В качестве алкилирующих агентов как необратимых ингибиторов в биохимии находят применение иодацетамид, монойодацетат и др.

Явление необратимого ингибирования используется в народном хозяйстве и медицине. На нем основано применение инсектицитов (средств для борьбы с насекомыми), некоторых лекарственных препаратов (антихолинестеразные средства). На их основе созданы боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия из группы фосфорорганических соединений.

В отличие от ингибиторов необратимого действия обратимые ингибиторы лишь на определенный промежуток времени понижают активность ферментов. Механизм их ингибирующего эффекта можно представить в виде следующих уравнений реакций:

In + E EIn

In + ES ESIn

Как следует из представленных уравнений реакций, обратимые ингибиторы обратимо присоединяются к ферменту или фермент-субс-тратному комплексу. При этом фермент утрачивает свои каталитические свойства.

Обратимые ингибиторы по механизму ингибирующего эффекта подразделяются на конкурентные инеконкурентные, которые отличаются друг от друга по механизму ингибирующего действия на фермент.

В случае неконкурентного ингибирования ингибитор обратимо присоединяется к ферменту не в его активном центре. В этом случае меняется конформация активного центра, что приводит к обратимой инактивации энзима. Под влиянием конкурентного ингибитора не происходит изменения сродства фермента к его субстрату, т.е. не изменяется величина К м, но понижается максимальная скорость ферментативной реакции (V max). В качестве неконкурентных ингибиторов могут выступать промежуточные продукты обмена веществ.

Молекулы конкурентных ингибиторов имеют определенное сходство с истинным субстратом фермента. Классическим примером конкурентных ингибиторов является малоновая кислота, которая обратимо понижает активность фермента сукцинатдегидрогеназы.

Янтарная кислота Малоновая кислота

Из представленных формул видно, что малоновая кислота действительно сильно напоминает по строению янтарную. Структурное сходство позволяет малоновой кислоте связываться с активным центром фермента сукцинатдегидрогеназы. Однако это соединение не способно вступать в реакцию, катализируемую данным ферментом (реакцию дегидрирования). Поэтому ингибитор присоединяется к активному центру фермента, блокируя тем самым возможность его взаимодействия с истинным субстратом. Таким образом, под влиянием конкурентного ингибитора резко понижается срод-ство фермента к субстрату (возрастает величина К м), но не меняется величина V max . Явление конкурентного ингибирования может быть снято путем резкого повышения концентрации субстрата в реакционной смеси.

Таким образом, конкурентные ингибиторы в отличие от неконкурентных связываются с активным центром фермента, вследствие чего наступает резкое повышение величины К м к субстрату, что и лежит в основе обратимого понижения его активности.

В качестве физиологического конкурентного ингибитора сукцинатдегидрогеназы выступает щавелево-уксусная кислота. Как видно из представленного рисунка, этот промежуточный продукт обмена веществ также имеет определенное структурное сходство с янтарной кислотой. Конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы щавелево-уксусной кислотой играет важную роль в регуляции окислительно-восстановительных превращений в митохондриях:

Существует еще один вид регуляции активности ферментов – аллостерическая регуляция . Он характерен для особой группы энзимов – аллостерических ферментов . К аллостерическим ферментам относятся олигомерные белки, в структуре которых имеются регуляторные (аллостерические) центры.

В составе молекул аллостерических ферментов выделяются два типа субъединиц:

1) каталитические (С );

2) регуляторные (R ).

Каталитические субъединицы представлены полипептидной цепью, на которой находится активный центр фермента. Регуляторные субъединицы содержат в своей структуре регуляторный (аллостерический) центр. Аллостерический центр представляет собой участок молекулы, способный специфически взаимодействовать с регулятором фермента. Соответственно регуляторы могут выступать в роли как активаторов, так и ингибиторов фермента.

Связывание аллостерического регулятора с регуляторным центром происходит за счет стерического соответствия его молекулы аллостеричес-кому центру. Ввиду геометрического сходства поверхности молекулы регулятора и трехмерной структуры аллостерического центра между ними происходит обратимое специфическое взаимодействие. Образуется комплекс, который стабилизируется силами слабых взаимодействий. Особое значение при этом приобретают Ван-дер-Ваальсовы силы. Помимо них, в стабилизации комплекса регулятора с аллостерическим центром участвуют водородные связи, а также гидрофобные и электростатические взаимодействия.

В результате взаимодействия фермента с аллостерическим ингибитором в молекуле белка возникают конформационные сдвиги в полипептидной цепи регуляторной субъединицы. Их возникновение сказывается на взаимодействии С - и R -субъединиц. В результате этого вторично изменяется конформация полипептидной цепи каталитической субъединицы. Подобная перестройка сопровождается возникновением сдвигов в структуре активного центра, следствием чего служит понижение сродства активного центра к субстрату (повышение величины К м), что и предопределяет ингибирование фермента (рис. 33).

Рисунок 33 – Механизм аллостерического ингибирования фермента

Присоединение аллостерического ингибитора к аллостерическому центру приводит к изменению конформации активного центра на каталитической субъединице фермента и понижению его сродства к субстрату.

Аллостерическое ингибирование является обратимым. Диссоциация комплекса R -субъединицы с ингибитором сопровождается восстановлением исходной конформации полипептидных цепей субъединиц, в результате чего сродство активного центра к субстрату восстанавливается.

Очень часто в роли аллостерических ингибиторов выступает продукт реакции или метаболического пути, в котором участвует фермент. Процесс ингибирования фермента продуктом реакции называетсяретроингибированием .

Ретроингибирование лежит в основе механизма отрицательной обратной связи в регуляции обменных процессов и поддержании гомеостаза. За счет него обеспечивается поддержание постоянного уровня различных промежуточных продуктов обмена веществ в клетках. Примером ретроингибирования может служить ингибирование гексокиназы продуктом реакции глюкозо-6-фосфатом:

В некоторых случаях ингибирование происходит не за счет конечного продукта реакции, а конечного продукта процесса, в котором происходит реакция. Ретроингибирование фермента Е продуктом процесса Р:

где Б, В, Г, Д – промежуточные продукты.

В представленной последовательности превращений в качестве аллостерического ингибитора фермента Е выступает продукт процесса – Р . Подобный механизм ретроингибирования широко встречается в клетках. В качестве примера можно привести ингибирование фермента ацетил-КоА-карбоксилазы, принимающего участие в синтезе высших жирных кислот, конечным продуктом синтеза жирных кислот – пальмитиновой кислотой.

Аналогичным, но противоположным образом действуют на аллостерические ферменты аллостерические активаторы . В отсутствии активатора фермент имеет низкое сродство к субстрату. Однако при соединении ал-лостерического центра с активатором происходит повышение сродства каталитического центра к субстрату, что сопровождается повышением скорости превращения субстрата. В качестве аллостерических активаторов часто выступает молекула субстрата реакции. В этом заложен глубокий биологический смысл. В условиях, когда в клетке возрастает содержание субстрата, для поддержания постоянства внутренней среды появляется необходимость в его утилизации. Это достигается за счет активации фермента, который катализирует его превращение. Примером подобной активации может быть активация глюкокиназы глюкозой.

Аллостерические ферменты, у которых субстрат выступает в роли активатора называются гомотропными. На этих ферментах имеется несколько одинаковых по строению центров связывания субстрата, которые в зависимости от условий могут выполнять функцию и регуляторных, и каталитических центров фермента.

Как противоположность гомотропным ферментам существуют гетеротропные энзимы. Последние регулируются модуляторами, структура которых отличается от субстрата. Поэтому в их структуре выделяются существенно различающиеся по строению активный и аллостерический центры.

Очень часто один и тот же аллостерический фермент оказывается способным взаимодействовать с несколькими различными модуляторами – активаторами и ингибиторами. В качестве примера можно привести фермент – фосфофрктокиназу (ФФК), которая катализирует следующую реакцию:

При этом разные модуляторы, как правило, имеют свои участки связывания на молекуле фермента.

Кинетика гомотропных ферментов отличается от кинетики неаллостерических энзимов. График зависимости скорости реакции от концент-рации субстрата имеет у них не гиперболическую, а сигмовидную форму (рис. 34).

Рисунок 34 – Кинетика гомотропных ферментов

По этой причине для расчета К м у них неприемлемо уравнение Михаэлиса-Ментен.

Сигмовидный характер кинетики аллостерических ферментов связан с особым – кооперативным характером взаимодействия отдельных субъединиц энзима с субстратом. Связывание каждой следующей молекулы субстрата с участком связывания способствует возникновению конформационных перестроек в соседних субъединицах, следствием чего становится повышение их сродства к субстрату.

Изоферменты

Важное значение в обеспечении эффективного течения обменных процессов в клетках имеют изоферменты . Изоферменты представляют собой генетически детерминированные множественные формы фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но имеющие разную структуру и физико-химические свойства.

Типичным ферментом, который представлен изоферментами, является лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Этот энзим катализирует следующую реакцию.

При электрофорезе сыворотки крови человека в крови выявляется пять различных белковых фракций, которые обладают способностью катализировать лактатдегидрогеназную реакцию. Таким образом, можно прийти к заключению о существовании пяти изоферментов ЛДГ (рис. 35).

Рисунок 35 – Распределение изоферментов ЛДГ на электрофорерограмме (электрофорез проводится при рН 6,8)

Важное значение в объяснении феномена существования изоферментов имеет тот факт, что изоферменты встречаются только у ферментов – олигомерных белков. Их молекула состоит не меньше чем из двух субъединиц.

Что касается ЛДГ, то этот фермент представляет собой тетрамер, т.е. в его молекулу входит четыре отдельные субъединицы. При этом существует два различных типа субъединиц ЛДГ – М-тип (мышечный) и Н-тип (сердечный). Субъединица представляет собой полипептидную цепь, структура которой кодируется соответствующим геном, что и предопределяет генетическую природу изоферментов. В виду того что полипептиды субъединиц являются продуктами разных генов, они имеют:

· различный аминокислотный состав (первичную структуру);

· неодинаковые физико-химические свойства (электрофоретическую подвижность);

· особенности синтеза в разных тканях.

Ввиду различий в структуре изоферменты различаютсяи и по кинетике (сродству к субстрату), особенностям регуляции активности, а также локализации в клетках эукариот и тканевой специфичности в высших организмах.

В состав тетрамера молекулы ЛГД могут входить разные типы субъединиц в различных соотношениях. При образовании тетрамера возможна следующая комбинация субъединиц:

По этой причине становится понятной причина существования именно пяти изоферментов ЛДГ: ЛДГ 1 имеет минимальную электрофоретическую подвижность, а ЛДГ 5 – максимальную.

Гены изоферментов ЛДГ по-разному экспрессируются в различных тканях: в сердечной мышце синтезируется только субъединица Н-типа. Поэтому здесь образуется только ЛДГ 1 , которая состоит исключительно из этого типа суъединиц. В печени и скелетных мышцах синтезируется только суъединица М-типа. Поэтому здесь образуется и функционирует только изофермент ЛДГ 5 , состоящий исключительно из М-субъединиц. В остальных тканях с разной скоростью экспрессируются гены, кодирующие и Н-, и М-субъединицы. Поэтому в них могут образовываться различные промежуточные формы изоферментов ЛДГ (ЛДГ 2 –ДГ 4).

Ввиду того что субъединицы различаются по аминокислотному составу, они обладают неодинаковой молекулярной массой и электрическим зарядом. Это обусловливает их различные физико-химические свойства.

Помимо различий физико-химических свойств, изоферменты сильно различаются по каталитическим свойствам (по кинетическим параметрам: для них характерна различная величина числа оборотов (V max) и сродства к субстрату (К м), а также по чувствительности к действию различных регуляторов).

Так, у ЛДГ 1 величина К м по отношению к молочной кислоте составляет 0,0044 М , тогда как у ЛДГ 5 – 0,0256 М . Мочевина проявляет свойства ингибитора в отношении ЛДГ 5 , но не оказывает влияния на ЛДГ 1 . При этом в качестве ингибитора ЛДГ 1 выступает пировиноградная кислота, которая не оказывает аналогичного эффекта на ЛДГ 5 .

Таким образом, изоферменты различают по структуре и свойствам, а их существование генетически детерминировано. При этом возникает вопрос о биологической целесообразности изоферментов.

Для того чтобы разобраться в данном вопросе необходимо иметь ввиду, что в различных отделах (компартментах) клетки эукариот, а также в разных тканях многоклеточного организма, существуют различные условия. В них содержится неодинаковая концентрация одних и тех же субстратов и кислорода. Для них характерна различная величина рН и ионный состав. Поэтому в клетках разных тканей, а также в разных компартментах клетки одни и те же химические превращения фактически протекают в неодинаковых условиях. В этой связи существование изоферментов, обладающих различиями в каталитических и регуляторных свойствах, позволяет

1) осуществлять одни и те же химические превращения с одинаковой эффективностью в разных условиях;

2) обеспечивать тонкую регуляцию каталитических превращений в соответствии с особенностями распределения регуляторов в соответствующем компартменте клетки и разных тканях.

Указанное может быть проиллюстрировано особенностями свойств цитоплазматического и митохондриального изоферментов карбамоилфосфатсинтазы. Этот фермент катализирует реакцию синтеза карбамоилфосфата.

Карбамоилфосфат, образующийся в митохондриях, под действием митохондриального изофермента далее вовлекается в процесс образования мочевины, а карбамоилфосфат, образующийся под влиянием цитоплазматического изофермента, затем используется для синтеза пиримидиновых нуклеотидов. Естественно, что эти ферменты, связанные с совершенно различными обменными процессами, разделены пространственно и имеют различные каталитические и регуляторные свойства. Их присутствие в одной клетке позволяет одновременно происходить двум разным процессам, связанным с использованием одного предшественника.

Таким образом, существование изоферментов имеет важное биологическое значение, связанное с возможностью течения одних и тех же ферментативных процессов в разных условиях и по этой причине генетически детерминировано.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается сходство и различие между ферментами и небелковыми катализаторами?

2. Перечислите основные классы ферментов и охарактеризуйте их.

3. На чем основана современная международная номенклатура ферментов?

4. Дайте определение понятия энергетический барьер реакции.

5. Какие существуют взгляды на механизм понижения ферментами энергетического барьера реакции?

6. В чем заключается физический смысл константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции?

7. В каких единицах измеряется константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции?

8. Почему при повышении температуры реакционной смеси до температурного оптимума скорость ферментативной реакции возрастает?

9. Какие виды специфичности ферментов вам известны? С чем связана специфичность ферментов?

10. Почему активность ферментов зависит от рН среды? Активность каких ферментов в большей мере зависит от этого фактора?

11. Какие методы количественного определения ферментов вам известны?

12. В чем измеряется активность ферментов?

13. В чем заключаются принципиальные различия между обратимыми и необратимыми ингибиторами?

14. Что такое конкурентные ингибиторы? Какие конкурентные ингибиторы вам известны?

15. Каков механизм аллостерического ингибирования?

16. В чем заключается биологическая целесообразность существования изоферментов?

17. Какие методы фракционирования изоферментов вам известны?

Глава 6. ВИТАМИНЫ

Витаминами называются органические вещества, которые в малых количествах необходимы для обеспечения нормального обмена веществ и физиологических функций, не синтезируются в организме и являются обязательными компонентами пищи.

Необходимость витаминов для обеспечения жизнедеятельности организма связана с тем, что большинство из них участвует в образовании коферментов. Ввиду того что для обеспечения нормального течения каталитических процессов требуются очень небольшие количества ферментов, которые к тому же не расходуются в процессе химических реакций, витамины тоже необходимы организму в очень небольших количествах.

В настоящее время известно более 20 витаминов. Основными их источниками являются:

· пища животного и растительного происхождения;

· сапрофитная микрофлора толстого кишечника;

· провитамины.

Провитамины представляют собой предшественники витаминов, из которых в организме различными путями происходит образование активных витаминов. К их числу относятся каротин (провитамин А), 7-дегидро-холестерин (провитамин D) и др.

Помимо витаминов, выделяется особая группа витаминоподобных веществ . Эти вещества обладают свойствами витаминов, но синтезируются в организме человека. К ним относятся карнитин, инозитол, липоевая кислота, холин, пангамовая кислота, витамин U и др. Витаминоподобные вещества проявляют свойства витаминов у соответствующих видов организмов.

Наряду с витаминами существует группа веществ – антагонистов, которые обозначаются термином антивитамины . К ним относятся вещества, которые проявляют действие, противоположное действию витаминов.

Антивитамины можно условно подразделить на две группы в зависимости от механизма их антивитаминного эффекта.

1. Ферменты, разрушающие витамины. Примером представителей этой группы могут служить тиаминаза (фермент, катализирующий превращения витамина В 1), аскорбатоксидаза (фермент, катализирующий превращения витамина С) и т.д.

2. Вещества, обладающие сходной с витаминами структурой, за счет чего способные вступать с витаминами в конкурентные отношения за общие участки связывания. В эту группу входят и производные витаминов (окситиамин и др.).

Потребность в витаминах зависит от множества различных причин. К ним относятся пол, возраст, время года, географическая широта обитания, физическое состояние, характер труда, состояние здоровья и др.

В том случае, когда возникает нарушение соответствия между потребностью организма в витамине и уровнем его поступления в организм, наступает состояние витаминного дисбаланса. Проявлением витаминного дисбаланса могут служить:

· гиповитаминозы;

· авитаминозы;

· гипервитаминозы.

Гиповитаминозы представляют собой состояния, при которых уменьшается содержание витамина в организме. Существует две основные группы причин (внешние и внутренние ), которые приводят к их возникновению.

1. К внешним относятся причины, которые приводят к снижению поступления витаминов в организм с пищей (голодание, употребление в пищу продуктов, содержащих малое количество витаминов или подвергнутых неправильной кулинарной обработке).

2. Внутренние причины связаны с увеличением потребности организма в витаминах при определенных состояниях (детский возраст, беременность, тяжелый физический труд, при стрессе и различных внутренних заболеваниях) или с нарушением усвоения витаминов в организме (при различных заболеваниях, связанных с поражением желудочно-кишечного тракта).

Гиповитаминозы имеют довольно широкое распространение. Особенно часто они встречаются в весенний период года.

Авитаминозы представляют собой крайнюю форму гиповитаминозов. Они характеризуются исчезновением из организма отдельных витаминов. Чаще всего причиной авитаминозов служит прекращение поступления витаминов в организм с пищей. В настоящее время это состояние встречается довольно редко. Оно может возникать у тех контингентов людей, которые работают в экстремальных условиях (военные, геологи, моряки и др.).

Гипервитаминозы представляют собой состояния, при которых увеличивается содержание витаминов в организме. Причиной их возникновения чаще всего служит увеличение поступления витаминов с пищей. Наиболее характерно возникновение гипервитаминозов для жирорастворимых витаминов. Оно может возникать при длительном употреблении в пищу продуктов, богатых определенными витаминами, а также от передозировки витаминных препаратов.

Классификация витаминов

В основу современной классификации витаминов положена их раст-воримость. По этому признаку все витамины подразделяются на:

· жирорастворимые – витамины А, D, Е, К, F, Q;

· водорастворимые – витамины группа В (В 1 , В 2 , В 3 , В 5 , В 6 , В 12 , В с), а также РР, С, Н и рутин.

Жирорастворимые витамины

Для этой группы витаминов характерен целый ряд общих свойств:

1. В структуру многих жирорастворимых витаминов входят остатки молекул изопрена. Они соединяются друг с другом в цепи определенной длины, которые во многом и определяют нерастворимость жирорастворимых витаминов в воде и наоборот – хорошую растворимость в органических растворителях:

2. Для обеспечения всасывания жирорастворимых витаминов необходимо наличие достаточного количества желчных кислот в кишечнике, а также достаточное содержание жиров, как их растворителей, в пище.

3. Ввиду того что жирорастворимые витамины нерастворимы в воде, они переносятся в организме кровью с помощью особых белковых переносчиков. Как правило, каждый витамин переносится своим белком-переносчиком.

4. Жирорастворимые витамины способны накапливаться в тканях внутренних органов. В качестве их “депо” наиболее часто выступает ткань печени. Прекращение поступления жирорастворимых витаминов с пищей не сразу приводит к возникновению гиповитаминоза. Это связано с тем, что организм в течение некоторого времени способен обеспечиваться ими из собственных “депо”.

5. Для большинства жирорастворимых витаминов, не характерна коферментная функция.

6. Биологическая роль жирорастворимых витаминов связана с тем, что они обладают способностью регулировать экспрессию генов.

Однако, несмотря на определенные сходства, жирорастворимые витамины обладают существенными особенностями в проявлении своего биологического эффекта.

Витамин А