C.Grundker, G.Emons

Введение

Гипоталамический декапептид - гонадотропин-рилизинг-гормон (ГнРГ), также называемый ЛГ-РГ, играет важную роль в регуляции репродукции у млекопитающих (1-3). Он выделяется гипоталамусом в пульсирующем режиме и стимулирует синтез и выделение лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Длительное введение агонистов ГнРГ пролонгированного действия, приводящее к десенситизации гипофиза, используется для селективной медикаментозной гипофизэктомии и кастрации при некоторых патологиях (1,2,4,5). Недавно стали доступными для клинических испытаний потенциальные антагонисты ГнРГ, такие как цетрореликс, ганиреликс, антареликс, рамореликс и др. (4,5,6). Они конкурентно блокируют гипофизарные рецепторы к ГнРГ и тормозят выделение гонадотропинов с самого начала введения, без первоначального выброса ЛГ и ФСГ, который случается при использовании агонистов и может вызвать обострение имеющихся заболеваний (4,7).

Кроме этого хорошо известного классического гипофизотропного действия, ГнРГ может модулировать активность головного мозга и многих периферических органов (1,4,8-13). Предполагается наличие аутокринной/паракринной функции ГнРГ в плаценте (14-17), клетках гранулезы (18-20), миометрии (21) и лимфоидной ткани (22-24). Возможно, что аутокринные системы, основанные на действии ГнРГ, присутствуют во многих злокачественных опухолях, включая рак молочной железы, яичников, эндометрия и простаты.

В настоящей главе мы представляем наши знания об основном механизме действия ГнРГ, и о его различиях в гипофизе, нормальных экстрагипофизарных тканях и раковых клетках.

Гонадотрофы гипофиза и другие нормальные ткани

Рецепторы к ГнРГ

ГнРГ связывается со своими специфическими рецепторами. Клонирование ГнРГ-рецепторов различных видов млекопитающих (10, 25-31) выявило их принадлежность к большому семейству трансмембранных рецепторов, связывающихся с протеином G (10,26,27,32,33). Рецептор к ГнРГ полностью лишен цитоплазматического С-концевого участка, играющего роль в развитии быстрой десенситизации (34). После связывания гормона ГнРГ действует через токсин-устойчивые протеины G, вероятно принадлежащие к семейству Gq (35). Вероятно, следующими этапами передачи сигнала является активация фосфолипаз и кальциевых каналов Gq-протеинами (рис. 1).

Активация фосфолипаз и мобилизация ионов кальция

Активация инозитол-фосфатного пути изменяет физиологию клеток путем высвобождения ионов кальция из ЭПС в ответ на вхождение внешних ионов кальция через потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа (36, 37). Главным этапом этого пути является связь трансмембранного рецептора к ГнРГ с фосфолипазой С (ФЛС) с помощью Gq-протеинов (25, 38-40). Gq-протеин активируется при соединении ГнРГ со своим рецептором (35,41-45). В результате активации G-протеин распадается на две субъединицы, способные активировать различные виды ФЛС, а именно ФЛС-бета-1 и ФЛС-бета-2 (46-48). Эти два типа ФЛС могут катализировать гидролиз фосфатидилинозитол 1,4,5-трифосфата (IP3) и диацилглицерина (ДАГ) (36,37,49). IP3 способен открывать кальциевые каналы в ЭПС, высвобождая большие запасы ионов кальция в цитоплазму ЭПС в ответ на вхождение внешних ионов кальция через потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа (36,37). ДАГ активирует протеинкиназу С (ПКС), которая в свою очередь активирует протонный насос обмена ионов натрия на протоны. Результатом является повышение концентрации внутриклеточных ионов кальция и повышение внутриклеточного рН (36, 37). После непродолжительной латентной фазы (1-2 мин), фосфолипаза D (ФЛD) и фосфолипаза А2 (ФЛА2) активируются ГнРГ за счет продукции фосфатидилэтанола (ФЭ), фосфорной кислоты (ФК) или арахидоновой кислоты (АК) (50-54). Поскольку ФК превращается в ДАГ за счет ФК-фосфогидролазы, ДАГ продуцируется последовательно, сначала за счет активации ФЛС, затем - за счет ФЛD, давая возможность селективной активации различных подвидов ПКС.

Рис. 1. Предполагаемый молекулярный механизм передачи сигнала рецептором к ГнРГ в гипофизе. Асс. Reiss et al (73) , с добавлениями.

Роль протеинкиназы С

Семейство ПКС состоит как минимум из 10 изоферментов, подразделяющихся на те, которые содержат кальций-связывающий домен, и те, которые его не содержат (55,56). Изоформы ПКС классифицируются на три группы: стандартные ПКС (сПКС: альфа, бета-1, бета-2, гамма), новые ПКС (нПКС: дельта, эпсилон, ню, мю, тэта) и атипичные ПКС (аПКС: сигма, лямбда, и) (57). сПКС активируются ионами кальция, ДАГ и фосфатидилсерином (ФС). нПКС являются кальций-независимыми и активируются ДАГ и ФС. аПКС являются кальций- и ДАГ-независимыми и активируются ФС и PIP2 (57). Гонадотрофы гипофиза экспрессируют ПКС-альфа, бета, дельта, эпилон и сигма (58). ПКС состоит из С-концевого киназного домена и N-концевого регуляторного домена. Регуляторный домен связывает и блокирует каталитический домен. Некоторые вещества высвобождают каталитический домен: ионы кальция, ДАГ, АК, ФС, форболовые эфиры (55,56,59,60). Вещества, модулирующие действие ПКС, можно разделить на те, которые влияют на каталитический домен, и те, которые влияют на регуляторный домен (61,62). ПКС играет ключевую роль в передаче сигнала от различных лигандов в различных тканях (57,63,64). Быстрая активация фосфоинозитида ГнРГ может поставлять ионы кальция и ДАГ, необходимые для активации сПКС (46). После короткого латентного периода ГнРГ-активированная ФЛD приводит к образованию новой порции ДАГ, видимо, участвующего в активации нПКС. Наконец, АК, образующаяся при активации ФЛА2, поддерживает селективную активацию изоформ ПКС самостоятельно или вместе с другими кофакторами (52, 65, 66). ГнРГ-активированная ПКС переносится из цитозоля в мембрану. Ингибиторы ПКС блокируют действие ГнРГ - выброс ЛГ и экспрессию мРНК, отвечающей за синтез субъединиц гонадотропинов (67, 68). Однако гипотезы о роли ПКС в передаче сигнала ГнРГ противоречивы (69). Вовлечение ПКС в стимуляцию секреции гонадотропинов посредством ГнРГ позволяет предположить, что фосфорилирование белков коррелирует с выбросом гонадотропинов. Дефосфорилирование белков тоже вовлечено в стимуляцию секреции гонадотропинов ГнРГ, но возможно этот механизм действия является следствием мобилизации ионов кальция. ПКС-альфа и бета являются потенциальными кандидатами в медиаторы внеклеточного ответа на ГнРГ (69). Последние результаты показывают, что подъем уровня ПКС-бета, дельта и эпсилон опосредуется ионами кальция и саморегулируется ПКС, что позволяет предположить, что эти подвиды ПКС принимают участие в осуществлении ГнРГ своего действия (70, 71).

Роль митоген-активированной протеинкиназы

Рецептор к протеин-тирозин-киназе (РПТК, рецепторы фактора роста), также как G-протеин-связанные рецепторы, принимает участие в селективной активации ряда цитозольных протеинкиназ, известных как митоген-актививированные протеин-киназный (МАПК) каскад (72). Путь передачи сигнала МАПК, состоящий из серин/треонин протеин-киназ, рибосомальной S6-киназы, - наиболее известен. Каскад киназ, акитвируемых МАПК, усиливает воспринятый сигнал и повышает чувствительность клеток к нему. ГнРГ рецептор активирует каскад МАПК за счет альтернативного механизма, включающего ПКС-зависимые и независимые пути, бета-гамма-субъединицы G-протеинов и другие пути (посредством Ras, Rsf-1 и др) (72). Фосфорилированный комплекс МАПК переносится в ядро, активирует факторы транскрипции, такие как c-fos, инициируя клеточный ответ, включающий рост и дифференцировку. В клетках гипофиза ГнРГ стимулирует МАПК, вовлекая ее в экспрессию гена альфа-субъединицы гонадотропинов. ПКС и мобилизованные ионы кальция принимают участие в активации МАПК ГнРГ (73).

ПКС- и кальций-зависимый каскад МАПК также вовлекается в отрицательную регуляцию базальной и ГнРГ-стимулированной транскрипции рецептора ГнРГ.

Роль арахидоновой кислоты

Активация ФЛА2 приводит к высвобождению АК из клеточных фосфолипидов и к образованию эйкозаноидов (75). Было обнаружено, что АК и некоторые продукты липооксигенации вовлечены в секрецию гонадотропинов и экспрессию субъединиц гонадотропинов, активированные ГнРГ (36,52,72,75-77). АК и ее производные могут действовать путем активации специфических изоформ ПКС. Образующиеся под действием ГнРГ лейкотриены могут быть первичным мессенджером в аутокринно-паракринной цепи усиления сигнала ГнРГ (75).

Путь Jun N-концевой киназы

Путь МАПК не является единственным способом передачи сигнала от ГнРГ в ядро. Исследовательская группа Naor (78) показала, что путь Jun N-концевой киназы (JNK) значительно активируется при ответе на ГнРГ. JNK-каскад использует частичную активацию р21-активированной киназы (РАК1/MLK), МАПК, стресс-активированной протеин киназы 1/МАПК7 (SEK1/МАПК7) и JNK1/2 для активации факторов транскрипции, таких как c-Jun, AFT2, Elk1 (79, 80). ГнРГ-индуцированная активация JNK-пути более масштабна, чем каскад МАПК, но занимает больше времени (78). Стимуляция активности JNK опосредуется уникальным путем, включающим частичную активацию ПКС, с-Src, CDC42, МАПК1 (78).

Взаимодействия между каскадами передачи сигнала ГнРГ

ГнРГ-индуцированный синтез и секреция гонадотропинов опосредуется различными взаимодействующими путями: мобилизированными ионами кальция, подвидами ПКС, АК и ее метаболитами, каскадом МАПК (81). Во время экзоцитоза ионы кальция и ПКС оказывают дополнительное влияние на секрецию гонадотропинов (68,70). Во время ГнРГ-индуцированной транскрипции альфа-субъединицы гонадотропинов и генов ПКС-бета, ионы кальция и ПКС действуют независимо друг от друга. ГнРГ-индуцированный синтез мРНК ЛГ-бета опосредуется либо ионами кальция, либо ПКС, однако одновременная активация обоих путей подавляет транскрипцию гена ЛГ-бета (52). ГнРГ-индуцированный синтез мРНК ФСГ-бета опосредуется изолированно ПКС, ионы кальция оказывают ингибирующее влияние. Взаимодействие ионов кальция и ПКС вовлечено в различные эффекты ГнРГ на секрецию и синтез гонадотропинов (49, 81). Возможно, что разные изоформы ПКС, такие как кальций-зависимые и кальций-независимые влияют на разные эффекты ГнРГ. Более того, стероидные гормоны прогестерон и эстрогены оказывают модулирующее влияние на передачу сигнала от ГнРГ (82-90).

ГнРГ рецепторы в нормальных внегипофизарных тканях

Данные о присутствии рецепторов ГнРГ в нормальных человеческих внегипофизарных тканях, включая молочные железы, плаценту, яичники и яички, противоречивы (8-10). Анализ Nothern blot не определил мРНК ГнРГ рецептора ни в одном образце внегипофизарных тканей (27). Однако при использовании ПЦР с обратной транскриптазой, этот вид мРНК обнаружен в клетках гранулезы (19).

В яичниках экспрессия мРНК рецептора ГнРГ находится под гомологической и гетерологической регуляцией. ГнРГ оказывает поолжительное влияние на уровень своих рецепторов, в то время как ЛГ и ХГЧ подавляют экспрессию рецепторов к ГнРГ на клетках гранулезы. Регуляция уровня ГнРГ рецептора тканеспецифическая, и доказана роль ГнРГ как аутокринной регулирующей системы в ячниках, помимо общеизвестной роди нейроэндокринного регулятора в передней доле гипофиза (20).

Koch et al (21) продемонстрировали, что мРНК ГнРГ экспрессируется в молочной железе беременных и кормящих крыс. Биоактивный ГнРГ обнаружен в молоке разных видов млекопитающих, в том числе и человека У девственных, беременных и кормящих крыс экспрессия мРНК ГнРГ рецептора обнаружена, идентичная с таковой в гипофизе. Однако лечение ГнРГ не приводило к активации аденилатциклазы или МАПК.

Некоторые исследователи обнаружили ГнРГ и его рецепторы в человеческом трофобласте (14-17, 91-93).

Экспрессия ГнРГ и его рецептора происходит в различных экстрагипофизарных тканях, в частности, в человеческом трофобласте (15,94), мононуклеарах крови (22), яичниках и клетках гранулезы (19,29), яичках (95,96), различных областях головного мозга (97). Передача сигнала от ГнРГ рецептора в нормальных экстрагипофизарных тканях продолжает изучаться, однако уже открытые механизмы совпадают с таковыми в гипофизе (10,98,99).

Экспрессия рецепторов к ГнРГ в клетках человеческих опухолей

В ранних исследованиях было показано, что клетки рака молочной железы, яичников, эндометрия, поджелудочной железы и простаты экспрессируют специфические рецепторы ГнРГ (1,2,4,100-104). Эти рецепторы отличаются от гипофизарных пониженным аффинитетом и высокой степенью захвата (4,103-105). Позднее выяснилось, что в клеточных линиях рака молочной железы, яичников, эндометрия и предстательной железы, так же как в исследуемых раннее биопсийных образцах, существует два типа связывающих молекул для ГнРГ: один тип с пониженным аффинитетом и высокой степенью захвата, второй - с обратными характеристиками. Последний сравним с гипофизарным рецептором к ГнРГ (4,103,104). В 1992 г был клонирован гипофизарный рецептор к ГнРГ (26). Авторы отметили экспрессию мРНК ГнРГ-рецептора в клеточной линии рака молочной железы MCF-7. Эти находки стимулировали подобные исследования, что привело к демонстрации транскрипции генов ГнРГ рецепторов в клеточных линиях рака яичников и эндометрия - в 80% первичных опухолей (104,106-108). В образцах рака яичников и эндометрия, и клеточных линиях обнаружена экспрессия мРНК гипофизарного ГнРГ-рецептора (высокий аффинитет, низкая способность к захвату) (106-110). Kakar et al (28) продемонстрировали, что нуклеотидная последовательность рецептора к ГнРГ в тканях опухолей молочной железы и яичников идентична таковой гипофизарного рецептора. Имеющиеся сегодня данные позволяют предположить, что клетки около 50% раков молочной железы (111) и около 80% раков яичников и эндометрия экспрессирую гипофизарные рецепторы к ГнРГ (высокоаффинные). Что касается рака предстательной железы, некоторые находки были опубликованы (103), но данных для сравнительного анализа недостаточно.

Экспрессия ГнРГ клетками раковых опухолей

С начала 80-х годов было известно, что молоко, так же как биопсийные образцы и клеточные линии рака молочной железы содержат ГнРГ (4,112). В 1991 Harris et al (12) описали экспрессию мРНК ГнРГ в двух клеточных линиях карциномы молочной железы. Недавно две группы исследователей независимо друг от друга продемонстрировали экспрессию ГнРГ клеточными линиями и большинством биопсийных образцов яичникового и эндометриального рака (11,108,113). Можно предположить, что существует механизм регуляции роста опухолей яичников, молочной железы, эндометрия, предстательной железы, основанный на действии ГнРГ.

Прямой противоопухолевый эффект аналогов ГнРГ в клетках человеческого рака

Прямой ингибирующий эффект агонистов ГнРГ на пролиферацию in vitro клеток культуры рака молочной железы был впервые продемонстрирован Blankenstein et al (114), Miller et al (115). Некоторые исследователи показали наличие дозо- и время-зависимого ингибирующего пролиферацию различных раковых клеточных линий in vivo действия агонистов и антагонистов ГнРГ (4,104,109,110,116,117). В большинстве раковых клеток, кроме клеточной линии рака яичников EFO-27, антагонисты ГнРГ действовали как агонисты, доказывая, что различия между агонистическими и антагонистическими аналогами ГнРГ в опухолевых клетках отсутствуют (109,118). Трансплантировав клеточную линию человеческого рака яичников OV-1063 в организм мышей, Yano et al (119) продемонстрировали значительное нгибирование опухолевого роста на фоне длительного введения антагониста ГнРГ цетрореликса, и отсутствие такого эффекта на фоне агониста трипторелина. Поскольку оба аналога ГнРГ вызывают сравнимое подавление гипофизарно-яичниковой оси, авторы предположили, что противоопухолевый эффект цетрореликса вызывается прямым действием на рецепторы в опухоли. Обнаружение прямого противоопухолевого эффекта аналогов ГнРГ в клетках яичникового и эндометриального рака описано и другими исследователями, и полностью или частично совпадает с результатами, представленными выше (104, 120-122). И наоборот, другие исследователи не смогли зафиксировать противоопухолевый эффект аналогов ГнРГ в клеточных линиях человеческого рака яичников и эндометрия, или наблюдали его только при крайне высоких концентрациях аналогов ГнРГ (123-125). Некоторые из этих противоречий могу быть объяснены тем фактом, что большинство используемых во второй группе исследований клеточных линий не экспрессируют высокоаффинные ГнРГ-рецепторы (104,126). Возможно также влияние различных условий эксперимента, различных видов аналогов ГнРГ. Что касается рака предстательной железы, разные группы исследователей отметили прямой антипролиферативный эффект аналогов ГнРГ in vitro и in vivo в моделях на животных (1,103,127-131).

Молекулярные механизмы, опосредующие прямой противоопухолевый эффект ГнРГ

Принимая во внимание кажущееся сходство ГнРГ-рецепторов в клетках периферического рака и гипофиза, кажется правдоподобным пердположение о том, что передача сигнала ГнРГ в опухолевых клетках имеет сходный механизм с таковым в клетках гипофиза, в частности путем ФЛС, ПКС. Ранние отчеты о механизмах передачи сигнала ГнРГ в опухолевых клетках рака молочной железы крыс, клеточных линиях рака молочной железы человека, биопсийных материалах рака яичников, подтверждают эту гипофизу (132-135). Мы провели исследования на клеточных линиях человеческого рака яичников (EFO-12, EFO-27) и эндометрия (HEC-1A, Ishikawa). Эти клеточные линии экспрессируют рецепторы к ГнРГ, их пролиферация блокируется аналогами ГнРГ (108-110). Хотя мы могли четко продемонстрировать активацию фармакологическими стимулами ФЛС, ПКС и аденилатциклазы в опухолевых клетках, агонист ГнРГ трипторелин в концентрациях, достаточных для блокирования пролиферации, не оказывал эффекта на активность этих сигнальных систем (136). Мы обнаружили, однако, что митогенный эффект факторов роста (эпидермальный фактор роста ЭФР, инсулиноподобный фактор роста ИПФР) в этих клеточных культурах блокируется трипторелином (136, рис. 2). Сопоставимые данные представлены Moretti et al (137) на клеточных линиях человеческого рака предстательной железы LNCaP, DU145. Эти находки подтверждаются отчетами о снижении аналогами ГнРГ экспрессии рецепторов ростовых факторов и их мРНК (119,137,138) и/или индуцируемой ростовыми факторами активности тирозин-киназы (134,136,137,139-143). Индуцируемая ростовыми факторами фосфориляция тирозина возможно блокируется аналогами ГнРГ за счет активации фосфотирозинфосфатазы (136,137,139,140,142,143, видимо, связывающейся с ГнРГ рецептором за счет Gi-протеина в опухолях репродуктивного тракта человека (144). Imai et al (144) предположили, что Gi-протеин, связывающийся с ГнРГ, может отвечать за различия в ответах периферических опухолей и передней доли гипофиза. Концепция торможения передачи митогенного сигнала ГнРГ-аналогами в раковых клетках изучалась нами более подробно. Мы продемонстрировали, что ЭФР-индуцированная активация МАПК блокируется в клетках рака яичников и эндометрия под действием агониста ГнРГ трипторелина (136). С помощью количественной ПЦР с обратной транскриптазой мы показали, что ЭФР-индуцированная экспрессия с-fos - необходимый компонент передачи митогенного сигнала - полностью блокируется в клетках рака молочной железы, яичников и эндометрия на фоне приема трипторерила, а также на фоне антагониста ГнРГ цетрореликса (146). Сходные эффекты были продемонстрированы в клеточной линии рака простаты LNCaP на фоне лечения агонистом ГнРГ гозерелином (137). В клетках рака простаты агонисты ГнРГ ингибируют пролиферацию, нарушая клеточные механизмы передачи стимулирующего сигнала ЭФР и ИПФР (137, 147). Sica et al обнаружили, что ГнРГ неэффективен в регуляции клеточного роста, когда используется изолированно в клеточных линиях как гормонально-зависимого, так и гормонально-независимого рака предстательной железы. Однако он нарушает стимулирующий эффект андрогенов на пролиферацию клеток LNCaP. ГнРГ тормозит митогенное действие ЭФР в андроген-независимых клетках РС-3. Он нарушает андроген-индуцированную экспрессию генов в клетках LNCaP и ЭФР-индуцированную экспрессию в клетках PC-3. ГнРГ действует как противоростовой фактор. Причины различной передачи сигнала ГнРГ в клетках гипофиза и периферического рака до сих пор неясны. Экспериментальные мутации в рецепторе ГнРГ нарушали связывание ГнРГ, взаимодействие рецептор - G-протеин, встраивание в мембрану (148-154), но ни в одной из исследуемых клеточных линий рака молочной железы, эндометрия, яичников мы не обнаружили мутации участка гена, кодирующего рецептор ГнРГ. Следовательно, особенности рецептора ГнРГ не играют роли в измененной передаче сигнала ГнРГ в раковых клетках (155). С другой стороны, некоторые нормальные и неопластические ткани экспрессируют различные тканеспецифические варианты гена рецептора ГнРГ (Kottler et al, неопубликованные данные). На сегодняшний день неизвестно, превращаются ли эти варианты в мембранные рецепторы или нет. В опухолевых клеточных линиях, изученных нами, альтернативных вариантов рецепторов ГнРГ обнаружено не было. Активные мутации G-протеина принимают участие в патогенезе некоторых новообразований, включая опухоли яичника (144,156). Возможно, что мутации G-протеина или его неизвестные подтипы ответственны за передачу сигнала ГнРГ в опухолях, а следовательно - за его антипролиферативное действие. Кроме того, было показано, что индуцированное агонистами ГнРГ торможение клеточной пролиферации основано на повышении внутриклеточной концентрации аннексина V за счет активации ПКС (117).

Перевод Малярской М.М.

Получение яйцеклеток

Для стимуляции используют инъекции препаратов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), хорионического гонадотропина (ХГ), а также блокаторов гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ).

Созревание яйцеклеток непосредственно не может быть определено неинвазивными методами. Поэтому о созревании яйцеклеток судят косвенно по росту фолликулов яичника. Рост фолликулов наблюдают с помощью аппаратов ультразвукового исследования. При достижении доминантным фолликулом определенного размера (16-20 мм) назначают процедуру извлечения яйцеклеток - пункцию фолликулов яичника. Пункцию фолликулов проводят под общей (чаще) или местной (реже) анестезией, иглу проводят трансвагинально, ход иглы контролируют аппаратом УЗИ. Целью пункции является аспирация (отсасывание) содержимого фолликула (фолликулярной жидкости). Полученную жидкость исследуют с помощью микроскопа для обнаружения яйцеклеток.

Обычно использование гормональных препаратов и проведение пункции фолликулов не вызывает негативных реакций у пациентки, но иногда могут возникнуть осложнения. Осложнением стимуляции суперовуляции является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ), который может развиться спустя несколько дней после окончания стимуляции. СГЯ возникает при созревании большого количества фолликулов, которые, трансформируясь в желтые тела, секретируют большое количество эстрогенов. При тяжелом течении СГЯ может потребоваться госпитализация больной. Осложнением пункции фолликулов может явиться гематома яичника.

При невозможности получить яйцеклетки у пациентки (отсутствие яичников, менопауза и пр.) возможно использование донорских яйцеклеток (то есть яйцеклеток другой женщины). В качестве донора яйцеклеток может выступать бескорыстный донор (родственница, знакомая) или платный донор. Условия работы с донором яйцеклеток регламентирует приказ N67 Минздрава РФ .

Получение спермы

Оплодотворение in vitro

Непосредственно ЭКО проводится врачами-эмбриологами в условиях эмбриологической лаборатории. Собственно оплодотворение проводят одним из двух способов:
1) инсеминация in vitro ;
2) интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ICSI, ИКСИ).
При первом, более простом способе к яйцеклеткам, которые находятся в питательной среде, добавляют суспензию сперматозоидов. Сперматозоиды добавляют из расчета 100-200 тыс. на одну яйцеклетку. В течение 2-3 часов один из сперматозоидов проникает в яйцеклетку и тем самым оплодотворяет её. При втором способе (ИКСИ) сперматозоид вводят в яйцеклетку «вручную» с помощью микрохирургических инструментов. ИКСИ используют при очень плохом качестве спермы, когда оплодотворение не может быть получено даже в чашке.

Перенос эмбриона в матку

Перенос эмбриона в матку осуществляют через 2-5 дней после оплодотворения яйцеклетки. Процедура не требует анестезии (обезболивания) и выполняется на гинекологическом кресле в течение нескольких минут. Эмбрион переносят в матку, проводя через шейку матки специальный эластичный катетер. Согласно приказу N 67 Минздрава РФ в полость матки не рекомендуется переносить более 4 эмбрионов, чтобы избежать многоплодной беременности . Современная практика ЭКО в России такова, что обычно осуществляют перенос 2 эмбрионов.

Эстрогены стимулируют рост яйцевода, матки, влагалища, разрастание внутреннего слоя матки - эндометрия, способствуют развитию вторичных женских половых признаков и проявления половых рефлексов. Кроме того, эстрогены ускоряют и усиливают сокращение мышц матки, повышают чувствительность матки к гормону нейрогипофиза - окситоцина. Они стимулируют развитие и рост молочных желез.

Под его воздействием происходит разрастание слизистой оболочки (эндометрия) матки, это способствует имплантации оплодотворенной яйцеклетки в матке. Прогестерон создает благоприятные условия для развития вокруг имплантированной яйцеклетки децидуальной ткани, поддерживает нормальное течение беременности за счет торможения сокращений мышц беременной матки и уменьшает чувствительность матки к окситоцину. Кроме того, прогестерон тормозит созревание и овуляцию фолликулов вследствии угнетения создания гормона лютропина аденогипофизом.

К экстрагенитальным эффектам половых гормонов относится, например, анаболическое действие андрогенов, т.е. усиление синтеза белка, катаболического действия прогестерона, влияние андрогенов и гестагенов на рост костей, повышение базальной температуры тела и т.п..

Клетки желтого тела яичников, кроме продукции стероидных гормонов, синтезируют белковый гормон релаксин. Усиленная секреция релаксина начинается на поздних стадиях беременности. Значение этого пептидного гормона состоит в ослаблении (релаксации) связки лобкового симфиза с другими тазовыми костями, механизм которого связан с увеличением уровня цАМФ в хондроцитах. Это приводит к распаду молекулярных компонентов их связи. Кроме того, под влиянием релаксина снижаются тонус матки и ее сократимость, особенно шейки. Таким образом, этот гормон готовит организм матери к предстоящим родам.

Регуляция секреции женских половых гормонов (прогестерона и эстрадиола) достигается с помощью двух гонадотропных гормонов-фоликулинстимулюючого (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ). Под влиянием ФСГ развиваются фолликулы яичников и увеличивается концентрация эстрадиола, а при преобразовании разорванного фолликула (под действием ПГ) в желтое тело - прогестерона. Накопленные в крови половые гормоны действуют на гипоталамус или непосредственно на гипофиз по принципу положительной или отрицательной обратной связи. Увеличенная концентрация эстрадиола приводит к повышению уровня ЛГ (положительная обратная связь), а прогестерон в большом количестве тормозит выделение ФСГ и ЛГ (отрицательная обратная связь, предотвращает созревание следующего фолликула).

Гормоны плаценты

Плацента осуществляет связь материнского организма с плодом, является одновременно легкими, кишками, печенью, почками и эндокринной железой для плода. Она имеет три основные структуры: хорионального, базальную мембрану и расположенную между ними паренхиматозную часть состоит из ворсин хориона, стволовой части и микроворсинчастого пространства.

Плацента выполняет много различных функций, в том числе метаболическую (образование ферментов, участие в расщеплении белков, жиров и углеводов) и гормональную (образует две группы гормонов - белковые и стероидные). Белковыми гормонами являются хорионический гонадотропин, плацентарный лактогенный гормон (соматомамотропин) и релаксин. К стероидным гормонам плаценты относятся прогестерон и эстрогены (эстриол). В плаценте выявлены также гипоталамические рилизинг-гормоны.

ФСГ - Связывается с рецепторами на мембранах своих клеток-мишеней в яичниках и яичках, в результате чего происходит активация аденилатциклазной системы. Образующийся цАМФактивирует протеинкиназу, которая фосфорилирует белки, опосредующий эффекты ФСГ. ФСГ ускоряет развитие фолликулов в яичниках и образование эстрогенов

ЛГ Как у мужчин, так и у женщин ЛГ необходим для репродукции. У женщин в процессе менструального цикла ФСГ стимулирует рост фолликулов и вызывает дифференцировку и пролиферацию клеток зернистого слоя.

Под действием ФСГ созревающие фолликулы секретируют всё возрастающие количества эстрогенов, среди которых наибольшее значение имеет эстрадиол, а также на их клетках экспрессируются и рецепторы к ЛГ. В результате к моменту созревания фолликула повышение уровня эстрадиола становится настолько высоким, что это приводит к активациигипоталамуса по принципу положительной обратной связи и интенсивному высвобождению ЛГ и ФСГ гипофизом. Этот всплеск уровня ЛГ запускает овуляцию, при этом не только высвобождается яйцеклетка, но и инициируется процесс лютеинизации - превращения остаточного фолликула в жёлтое тело, которое в свою очередь начинает вырабатывать прогестерон для подготовки эндометрия к возможной имплантации. ЛГ необходим для поддержания существования жёлтого тела примерно в течение 14 дней. В случае наступлениябеременности лютеиновая функция будет поддерживаться действием гормона трофобласта - хорионического гонадотропина. ЛГ также стимулирует клетки теки в яичниках, которые обеспечивают продукцию андрогенов и предшественников эстрадиола.

Гонадотропин-рилизинг-гормон , или гонадорелин , гонадолиберин , гонадотропин-рилизинг-фактор , сокращённо ГнРГ - один из представителей класса рилизинг-гормонов гипоталамуса. Существует также аналогичный гормон эпифиза.

ГнРГ вызывает усиление секреции передней долей гипофиза гонадотропных гормонов - лютеинизирующего гормона ифолликулостимулирующего гормона. При этом ГнРГ в большей степени влияет на секрецию лютеинизирующего, чем фолликулостимулирующего гормона, за что и называется нередко также люлиберин или лютрелин .

Гонадотропин-рилизинг-гормон по строению является полипептидным гормоном. Вырабатывается в гипоталамусе.

Секреция ГнРГ происходит не постоянно, а в виде коротких пиков, следующих друг за другом с строго определёнными временными интервалами. При этом интервалы эти различны у мужчин и у женщин: в норме у женщин выбросы ГнРГ следуют каждые 15 мин в фолликулярной фазе цикла и каждые 45 мин в лютеиновой фазе и во время беременности, а у мужчин - каждые 90 мин.

Введение экзогенного ГнРГ в режиме постоянной капельной инфузии или введение длительно действующих синтетических аналогов ГнРГ вызывает кратковременное увеличение секреции гонадотропных гормонов, быстро сменяющееся глубоким угнетением и даже выключением гонадотропной функции гипофиза и функции половых желёз вследствие десенсибилизации рецепторов ГнРГ гипофиза.

В то же время введение экзогенного ГнРГ с помощью специальной помпы, имитирующей естественный ритм пульсации секреции ГнРГ, обеспечивает длительную и стойкую стимуляцию гонадотропной функции гипофиза, причём правильный режим помпы обеспечивает правильное соотношение ЛГ и ФСГ по фазам цикла у женщин и правильное, характерное для мужчин, соотношение ЛГ и ФСГ у мужчин.

Хорионический гонадотропи н обладает биологическими свойствами как ЛГ, так и ФСГ, и связывается с обоими типами рецепторов к гонадотропинам, но лютеинизирующая активность у ХГ значительно преобладает над фолликулостимулирующей. ХГ по лютеинизирующей активности значительно превосходит «обычный» ЛГ, производимый передней долей гипофиза.

Именно благодаря секреции значительных количеств ХГ плацентой плода жёлтое тело, в норме существующее около 2 недель в течение каждого менструального цикла, у беременных не подвергается рассасыванию и остается функционально активным в течение всего срока беременности. Причём жёлтое тело у беременных под влиянием ХГ производит очень большие количества прогестерона, физиологически невозможные в норме в небеременном организме. Также ХГ стимулирует продукцию эстрогенов и слабых андрогеновфолликулярным аппаратом яичников.

В некоторой степени ХГ также обладает, по-видимому, кортикотропными свойствами, повышая стероидогенез в коре надпочечников и способствуя функциональной гиперплазии коры надпочечников у беременной. Повышение секреции глюкокортикоидов под влиянием ХГ может играть роль в механизмах адаптации организма беременной к стрессу, каким является беременность, а также обеспечивает физиологическую иммуносупрессию, необходимую для развития генетически наполовину чужеродного организма внутри матки. В связи с этим стоит отметить, что гипофизарные гонадотропины кортикотропными свойствами не обладают.

Хорионический гонадотропин также играет роль в развитии и поддержании функциональной активности самой плаценты, улучшает её трофику и способствует увеличению количества ворсин хориона.

В небеременном организме в норме ХГ отсутствует, однако он часто производится различными злокачественными опухолями (эктопическая продукция ХГ).

Введение экзогенного ХГ у женщин в середине цикла вызывает, помимо увеличения продукции эстрогенов и прогестерона в яичниках, овуляцию, а затем лютеинизацию лопнувшегофолликула и в дальнейшем поддерживает функцию жёлтого тела.

Агонисты (аналоги) гонадотропин-рилизинг гормона

Гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ), вырабатывается гипоталамусом. Ему присуща ярко выделенная специфичность. ГнРГ создаёт довольно прочные комплексы, взаимодействуя чаще всего только с соответствующими рецепторами, которые расположены в передней доле гипофиза, также некоторыми белками. После того, как первая фаза активации гипофиза проходит (как правило, через 7-10 дней), чувствительность ГнРГ к стимулам начинает снижаться.

Тогда происходит понижение уровня ЛГ, ФСГ, приостанавливается стимуляция яичников. Уменьшается количество эстрогена, его уровень опускается ниже 100пмоль/л. Подобные характеристики наблюдаются у женщин, находящихся в постменопаузе. Количество продукции тостестерона, прогестерона, вырабатываемых яичниками, также уменьшается.

Агонисты гонадотропин-рилизинг гормона увеличивают вероятность наступления оплодотворения благодаря программам ЭКО.

Применение агонистов гонадотропинов имеет побочные эффекты. Как правило, появляются неприятные симптомы из-за недостаткка эстрогенов, развивается гипоэстрогенное состояние, сопровождающееся головной болью, потливостью, приливами, ощущением сухости во влагалище, перепадами настроения, депрессивными состояниями.

Наиболее опасно влияние агонистов на костную ткань, плотность которой может уменьшиться вследствие длительного применении данных лекарств. Существуют данные, согласно которым, некоторое восстановление костной ткани наблюдается на проятжении года после того, как окончено лечение агонистами.
Побочные действия вещества Трипторелин

Со стороны нервной системы и органов чувств: головная боль, нарушение сна, лабильность настроения, раздражительность, депрессия, астения, ощущение усталости, парестезия, нарушение зрения.Со стороны органов ЖКТ: тошнота, запор или диарея, анорексия, повышение массы тела, повышение активности печеночных трансаминаз, гиперхолестеринемия.Со стороны мочеполовой системы: симптомы, связанные с понижением уровня половых гормонов в крови, в т.ч. у мужчин - приливы крови к лицу, снижение либидо, импотенция, уменьшение размера яичек, гинекомастия; у женщин - «мажущие» выделения или сухость слизистой оболочки влагалища, снижение либидо, боль во время полового акта, приливы крови к лицу с профузным потоотделением.Со стороны опорно-двигательного аппарата: миалгия, боль в спине, деминерализация костной ткани.Аллергические реакции: кожная сыпь, гиперемия, зуд в месте введения, анафилактический шок, анафилактоидные реакции.Прочие: временное усиление симптомов (в т.ч. артралгия, прогрессирование гематурии или нарушения мочеиспускания), преходящая гипертензия, анемия, отечность ног.В случае передозировки необходимо немедленно прекратить лечение трипторелином и провести соответствующую симптоматическую терапию.

П/к, 1 раз в сутки. Начальная доза - 0,5 мг/сут (в течение 7 дней), поддерживающая доза - 0,1 мг/сут (начиная с 8-го дня).В программе экстракорпорального оплодотворения достаточно одной в/м инъекции на цикл стимуляции.Депо-формы: в/м, п/к, по 3,75 мг каждые 28 дней (у женщин - начиная с 3-го дня менструации), в течение не более 6 мес.

Препарат Золадекс ® 3,6 мг применяется для десенсибилизации гипофиза, которая определяется по концентрации эстрадиола в сыворотке крови. Как правило, необходимый уровень эстрадиола, который соответствует таковому в раннюю фолликулярную фазу цикла (приблизительно 150 пмоль/л), достигается между 7-м и 21-м днями. При наступлении десенсибилизации начинают стимуляцию суперовуляции (контролируемая стимуляция яичников) с помощью гонадотропина. Вызываемая десенсибилизация гипофиза при применении депо агониста ГнРГ может быть более стойкой, что может привести к повышенной потребности в гонадотропине. На соответствующей стадии развития фолликула введение гонадотропина прекращается и далее для индукции овуляции вводится человеческий ХГ. Контроль за проводимым лечением, процедуры извлечения ооцита и оплодотворения

Новое поколение:

Гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ, гонадотропин-рилизинг-фактор, гонадолиберин, гонадорелин) – это биологически активное вещество, по химическому строению являющееся полипептидом (декапептидом), которое продуцируется гипоталамусом.

Функции и роль гонадолиберина в организме

Рилизинг-гормоны представляют собой класс биологически активных веществ, которые вырабатываются гипоталамусом и влияют на функции щитовидной железы, яичников, яичек, молочной железы, гипофиза, надпочечников. Общим свойством всех рилизинг-гормонов является реализация их действия через стимуляцию выработки и секреции в кровь тех или иных биологически активных веществ гипофиза. Рилизинг-факторы имеют влияние на клетки передней доли гипофиза, которая вырабатывает ряд гормонов (тиреотропный, соматотропный, адренокортикотропный и др.).

Представителями класса рилизинг-гормонов гипоталамуса, помимо гонадолиберина, также являются:

• соматотропин-рилизинг-фактор;
• тиреотропин-рилизинг-фактор;
• кортикотропин-рилизинг-фактор и пр.

Гонадолиберин принимает участие в регуляции работы репродуктивной системы человека. Данное вещество стимулирует продукцию лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормона, при этом в большей степени он оказывает воздействие на выработку лютеинизирующего гормона. ЛГ и ФСГ принадлежат к гонадотропинам (гонадотропным гормонам), которые регулируют работу половых желез, выделяются передней долей гипофиза и плацентой. ЛГ в организме женщин стимулирует выработку эстрогенов (женских половых гормонов) яичниками, а в организме мужчин – тестостерона, главного андрогена (мужского полового гормона). ФСГ стимулирует развитие фолликулов в яичниках и продукцию эстрогенов, а также запускает процесс сперматогенеза у женщин и мужчин соответственно.

Выработка

Выработка гонадолиберина происходит не постоянно, а с определенными интервалами:

• у мужчин – каждые 90 минут;
• у женщин – через каждые 15 минут в фолликулиновой, каждые 45 минут в лютеиновой фазе менструального цикла и в период беременности.

Подобный ритм обеспечивает нормальное соотношение половых гормонов, на синтез которых он влияет, что особенно важно для женского организма.

Стимулируют секрецию гонадолиберина катехоламины, вырабатываемые надпочечниками:

• адреналин;
• норадреналин;
• дофамин.

Тормозит секрецию:

• серотонин;
• нервное перенапряжение;
• постоянное недосыпание.

Частая или непрерывная секреция приводит к потере рецепторами чувствительности и развитию ряда патологических состояний, например, к нарушению менструального цикла. Снижение секреции наблюдается реже, это может приводить к аменорее, отсутствию овуляции.

Использование гонадолиберина в медицине

Лекарственные средства на основе гонадолиберина назначаются при наличии у пациента нарушений со стороны репродуктивной системы, например, бесплодии, при его лечении методом искусственного оплодотворения и в ряде других случаев.

Введение экзогенного гонадолиберина в режиме постоянной внутривенной капельной инфузии или его длительно действующих синтетических аналогов приводит к кратковременному увеличению выработки гонадотропинов, после чего происходит угнетение функции половых желез и гонадотропной функции гипофиза. Однако при введении экзогенного гонадолиберина посредством помпы, которая имитирует ритм естественной пульсации выработки данного вещества, происходит продолжительная и стойкая стимуляция гонадотропной функции гипофиза. При правильном режиме такой помпы у женщин наблюдается обеспечение секреции лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, которая соответствует фазам менструального цикла, а у мужчин – соотношению гонадотропинов, характерному для их пола.

Препараты гонадолиберина выпускаются в различных формах:

• растворы для внутримышечных и подкожных инъекций;
• назальный спрей;
• подкожные капсулы (капсулы депо).

При наличии у пациента доброкачественных и злокачественных новообразований и некоторых других заболеваний также могут назначаться препараты ГнРГ (к примеру, при опухолях молочной железы, раке простаты, эндометриозе, гиперпластических процессах эндометрия и пр.).

Препараты гонадолиберина не следует использовать бесконтрольно, так как это может привести к ухудшению состояния пациента. Назначать их должен только лечащий врач.

В целях предотвращения развития патологического процесса и в дополнение к основному лечению рекомендуется коррекция режима дня, избегание стрессов, сбалансированное питание, отказ от вредных привычек.

Аналоги гонадолиберина

На сегодняшний день натуральный гонадолиберин в качестве лекарственного средства практически не применяется, так как имеет короткий период полувыведения. Вместо этого используются его аналоги, действие которых является более продолжительным. Кроме того, синтетические аналоги гонадолиберина обладают в 50-100 раз большей активностью, чем сам гонадотропин-рилизинг гормон.

Аналоги ГнРГ связываются с рецепторами гонадолиберина в гипофизе и обусловливают выделение лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, одновременно снижая продукцию гормонов яичников. Данное свойство этих препаратов используется для лечения пациенток с миомой матки. Они могут применяться при преждевременном половом созревании у детей, перед и после операции по поводу эндометриоза.

Синтетические аналоги гонадотропин-рилизинг гормона нашли применение не только в гинекологии, но и в онкологии – они способны оказывать воздействие на клетки опухоли, угнетая опухолевый рост. Специфические рецепторы к ГнРГ были выявлены в тканях многих злокачественных новообразований (образцах рака молочной железы, предстательной железы, яичников).

Препараты агонисты гонадотропин-рилизинг гормона и его антагонисты

В медицине используются агонисты ГнРГ и антагонисты. Агонисты оказывают помощь в усилении его выработки, а антагонисты, путем прямого воздействия на рецепторы гонадолиберина, блокируют их и подавляют секрецию гонадолиберина.

В таблице представлены названия некоторых часто назначаемых агонистов и антагонистов гонадолиберина.

Агонисты ГнРГ используются в лечении эндометриоза, в сочетании с препаратами железа – в лечении железодефицитной анемии на фоне меноррагии.

Антагонисты гонадотропин-рилизинг гормона применяются во вспомогательных репродуктивных технологиях, например, определенная схема введения используется при необходимости добиться суперовуляции (одновременного созревания нескольких яйцеклеток, то есть подготовки яичниками не одного, а двух фолликулов за один менструальный цикл) при проведении искусственного оплодотворения. Также агонисты могут использоваться на протяжении 2-4 месяцев для предоперационной подготовки при миоме матки и меноррагиях.

Видео

Предлагаем к просмотру видеоролик по теме статьи.