Способы окраски бактерий. Методы окраски микробиологических препаратов. Расположение спор в клетке

16.05.2024

Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод окраски бактерий, позволяющий отнести клетки по типу окраски стенки к грациликутам (грамотрицательным) или фирмикутам (грамположительным).

На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги, на него наливают карболовый раствор генцианвиолета на 30-50 секунд. Сливают краситель, удаляют бумажку, наносят раствор Люголя на 60 секунд. Сливают раствор Люголя. Споласкивают препарат в 95° этаноле 30-50 секунд, пока не перестанет отходить краситель, что зависит от толщины мазка. Промывают препарат водой, докрашивают 30-60 секунд фуксином Пфейффера, промывают водой, подсушивают и микроскопируют. Микроскопическая картина: грамположительные бактерии - фиолетового, грамотрицательные - красного цвета.

Практика показывает, что более чистые препараты без ущерба для дифференциации получаются, если после окраски генцианвиолетом мазок слегка споласкивают водой, остатки которой стряхивают и только потом наносят раствор Люголя.

Модификация по А.П. Синеву. На фиксированный мазок кладут полоску бумаги с красителем, наливают 2-3 капли воды и окрашивают 2 минуты. Далее поступают как описано выше.

Модификация по Керри. Мазок окрашивают 1-2 минуты спиртовым раствором генцианвиолета, обрабатывают 1-2 минуты раствором йода, затем 30-40 секунд этанолом. Промывают. Повторно обрабатывают 1 минуту раствором йода, промывают, докрашивают 1-2 минуты фуксином или смесью сафранина с бриллиантовой зеленью.

Модификация Берка. Раствор А: 1%-ный раствор кристаллвиолета в дистиллированной воде.

Протрава: йод кристаллический – 1 г, йодистый калий - 2 г, дистиллированная вода – 100 мл.

Растворитель для обесцвечивания: этиловый эфир – 1 объем, ацетон – 3 объема.

Дополнительный краситель: 2%-ный раствор сафранина в дистиллированной воде.

Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в раствор А, Мазок ополаскивают в йодной протраве и покрывают его свежей протравой на 2 мин. Промывают водой, а затем растворителем для обесцвечивания до тех пор, пока стекающий растворитель не будет содержать краски. После подсушивания окрашивают дополнительными красителем 5-10 сек, промывают водой, микроскопируют.

Модификация Хукера

Раствор А: кристаллвиолет – 2 г, 95%-ный этанол - 20 мл.

Раствор Б: щавелевокислый аммоний – 0,8 г, дистиллированная вода - 80 мл.

Раствор А и Б в приготовленных объемах смешивают в темном флаконе и оставляют при комнатной температуре на 24 ч.

Раствор В: 2,5%-ный раствор сафранина (в 96%-ном этаноле) – 10 мл, дистиллированная вода - 100 мл.

Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в смесь растворов А и Б на 1 мин, после чего препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя 1 мин, затем вновь промывают водой и подсушивают; наносят 96%-ный этанол на 30 с, препарат тщательно промывают водой, подсушивают, помещают в раствор В на 10 секунд, слегка промывают водой, подсушивают, микроскопируют.

Тест с гидроксидом калия для контроля результатов окраски бактерий по Граму. Если окраска по Граму нечеткая, этот метод позволяет уточнить полученный результат.

Постановка теста. На предметное стекло наносят 1-2 капли 3%-ного раствора КОН. Агаровую культуру бактериологической петлей вносят в КОН, перемешивают и затем поднимают петлю вверх. Если культура в виде «нити» тянется за петлей - грамотрицательная, при отсутствии этого феномена - грамположительная бактерия.

Методы окраски кислотоустойчивых бактерий

Окраска по Циль-Нильсену. Готовят карболфуксиновый краситель: основной фуксин – 0,3 г, 95%-ный этанол - 10 мл, фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) - 5 мл, дистиллированная вода – 95 мл.

Основной фуксин растворяют в этаноле, добавляют растворенный в воде фенол, перемешивают, выдерживают 5-7 дней при комнатной температуре; перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу.

Растворитель для обесцвечивания (солянокислый спирт): этанол 95%-ный - 97 мл, соляная кислота концентрированная - 3 мл. Дополнительный краситель: метиленовый синий - 0,3 г, дистиллированная вода -100 мл.

Методика. На фиксированный нагреванием мазок наливают карбол-фуксиновый краситель, подогревают до отхождения паров (но не кипятить!). Через 5 минут промывают водой. Затем мазок обрабатывают 30-50 сек растворителем для обесцвечивания, промывают водой, после чего пленка бактерий на мазке становится бледно-розовой.

Мазок докрашивают 3-5 минут дополнительным красителем (метиленовый синий и т.д.), промывают водой, высушивают.

Кислотоустойчивые микроорганизмы в мазке красного цвета, другие - синего.

Окраска аурамином. Раствор А: аурамин - 1,5 г, родамин В - 0,75 г, глицерин - 75 мл, фенол расплавленный - 10 мл, вода дистиллированная - 50 мл.

Красители: фенол и глицерин растворяют в 25-30 мл воды, добавляют оставшийся объем воды и фильтруют через стекловату.

Раствор Б: 70%-ный этанол - 99,5 мл, кислота соляная концентрированная - 0,5 мл.

Раствор В: калий марганцевокислый - 0,5 г, вода дистиллированная - 99,5 мл.

Методика. Фиксированный над пламенем горелки мазок 15 мин окрашивают раствором А при комнатной температуре или при 37-38° С. Промывают под струей воды до обесцвечивания. Наливают на мазок на 3-5 мин раствор Б, промывают и докрашивают еще 2-4 мин раствором В. Промывают, высушивают, микроскопируют в люминесцентном микроскопе под иммерсией (возбуждающий светофильтр ВG-12, запирающий ОG-1).

Кислотоустойчивые бактерии желто-оранжевого цвета на темном фоне.

Окраска по Муху. Препарат выдерживает 24 часа в растворе метилвиолета (10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета, 100 мл 2%-ного водного раствора карболовой кислоты). На 1-2 минуты наносят раствор Люголя, далее на 1 мин 5%-ный раствор азотной кислоты и 10 секунд 3%-ный раствор соляной кислоты. Затем на препарат до прекращения отхождения краски наносят смесь этанола и ацетона (1:1), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Методы окраски спор

Метод Ауески. Высушенный на воздухе мазок без фиксации обрабатывают 2-3 мин (при подогревании) 0,5%-ной серной кислотой, промывают и фиксируют над пламенем. Окрашивают в течение 7-8 мин карболовым фуксином Циля при подогревании, краску сливают. Мазок обрабатывают 5-7 секунд 5%-ным раствором серной кислоты, промывают и докрашивают 4-5 мин метиленовой синью. При микроскопии вегетативная часть клетки синего, спора - красного цвета.

Метод Меллера. Фиксированный над пламенем мазок протравливают 2-3 мин 5%-ной хромовой кислотой, промывают, окрашивают карболовым фуксином Циля. Обесцвечивают и окрашивают также, как и по методу Ауески.

Метод Пешкова. Фиксированный мазок окрашивают метиленовой синью с подогревом до закипания. Краску смывают и докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота в течение 10 секунд. Промывают, высушивают. Споры синие, вегетативные клетки - красные.

Метод Шеффера-Фултона. На фиксированный нагреванием мазок, покрытый фильтровальной бумагой, наливают 0,5%-ный водный раствор малахитовой зелени. Мазок помещают на 5 мин над кипящей водой. Промывают и докрашивают 30 сек 2%-ным водным раствором сафранина. Промывают, высушивают. Споры ярко-зеленого цвета, вегетативные клетки - красно-коричневого.

Метод Трухильо. Мазок фиксируют над пламенем горелки, покрывают насыщенным водным раствором малахитовой зелени, подогревают до появления пара и окрашивают 3 минуты. Краску смывают водой и докрашивают мазок 0,25%-ным водным раствором основного фуксина в течение 1 мин. Промывают, высушивают. Споры зеленого цвета, вегетативные клетки - красного.

Метод Дорнера. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 5-10 мин карболовым фуксином при подогревании, 1 мин обесцвечивают солянокислым спиртом (3 мл концентрированной соляной кислоты и 97 мл 96%-ного этанола). Препарат промывают, высушивают фильтровальной бумагой и наливают на мазок тонким слоем 10%-ный раствор нигрозина в 0,5%-ном растворе формалина. Не промывая, мазок высушивают на воздухе и микроскопируют. Споры - красные, вегетативные клетки - бесцветные на черном фоне.

Метод Валъдмана. На фиксированный препарат наносят синьку Леф-лера (щелочную) и нагревают до кипения, затем охлаждают и промывают водой. Докрашивают 1%-ным раствором нейтральрот в течение 30 секунд. Микроскопическая картина: споры - синие, вегетативные клетки - красные.

Метод Ожешки. На нефиксированный мазок наливают 0,5%-ный раствор НС1 и подогревают 1-2 минуты. Сливают кислоту, промывают препарат водой, подсушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циль-Нильсена. Микроскопическая картина: споры – красного, вегитативные клетки – синего цвета.

Методы окраски капсул

Способ Романовского-Гимза. Фиксированный в этаноле или жидкости Никифорова мазок помещают в краску Романовского-Гимза (15-20 капель краски на 10 мл дистиллированной воды) на 15-20 мин. Промывают, высушивают. Тело бактерий окрашивается в темно-синий цвет, капсулы - в розовый.

Способ Ольта. Фиксированные мазки над пламенем горелки окрашивают 1-3 мин 2%-ным водным раствором сафранина (сафранин растворяют в горячей воде, фильтруют, применяют свежеприготовленный раствор). Тело бактерий окрашивается в коричневый цвет, капсула - в бледно-желтый.

Способ Ребигера. Нефиксированный мазок окрашивают в течение 15-20 сек раствором генцианвиолета в формалине (15-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40%-ного формалина, отстаивают, фильтруют), промывают водой. Тело бактерий - темно-фиолетового цвета, капсула - красновато-фиолетового.

Способ Антоны. Мазок окрашивают 2 мин 1%-ным водным раствором кристаллвиолета. Краску смывают 20%-ным водным раствором сульфата меди (СuSO 4 ·5Н 2 О), избыток раствора стряхивают и мазок, не промывая водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микробы - темно-фиолетовые, капсула - светло-голубая.

Способ Гинса. На предметное стекло наносят каплю черной туши, раз-веденной 1:3 дистиллированной водой и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. В капле туши суспензируют петлей культуру и делают мазок (подобно мазку крови). Высушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают карболфуксином Циля, разведенным 1:3. Тела бактерий - красные. Капсула на темном фоне видна в виде светлого ореола вокруг бактерий.

Способ Михина. Мазок окрашивают в течение 3-5 мин синькой Леф-флера (пригодна только краска, хранившаяся не менее 20-30 дней, т.к. при хранении в ней образуется азур, придающий метахроматичность). Тела бактерий - синие, капсула - розовая.

Способ Гисса. На предметное стекло наносят каплю нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади (или каплю обезжиренного молока), петлей вносят в нее культуру, суспензируют и готовят мазок. Высушивают пленку бактериальной суспензии на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают при подогревании в течение 1 мин 0,1%-ным водным кристаллвиолета. Мазок промывают 20%-ным водным раствором сульфата меди, высушивают фильтровальной бумагой. Капсулы в мазке - бледно-голубого, тела бактерий - темно-фиолетового цвета.

Способ Дюгида. На предметное стекло помещают каплю черной туши, суспензируют в ней культуру. Каплю покрывают покровным стеклом, фильтровальной бумагой удаляют излишки туши. На коричнево-черном фоне видны преломляющие свет бактерии, окруженные капсулой в виде прозрачной зоны.

Способ Ионе. На один конец поверхности предметного стекла наносят каплю туши, разведенной 1:2-1:4 дистиллированной водой. В капле суспензируют бактерии и готовят мазок (как мазок из крови). Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают 2 мин 2%-ным водным раствором генцианвиолета или 1%-ным раствором фуксина. Промывают водой, обрабатывают 8-10 секунд 2%-ным раствором уксусной кислоты и вновь промывают. В мазке вокруг интенсивно окрашенных бактерий видна неокрашенная капсула.

Метод окраски жгутиков

О наличии жгутиков у бактерий судят по косвенным признакам, например по подвижности клеток в препаратах «раздавленная капля», «висячая капля», а также по характеру роста испытуемой культуры в полужидком агаре (0,15-0,3%). В последнем случае испытуемую культуру засевают уколом в ПЖА и инкубируют в течение 18-24 часов. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии укола, вызывая помутнение среды, неподвижные растут только по уколу.

В отдельных случаях применят методы окраски, позволяющие наблюдать непосредственно жгутикию

При всех методах окраски следует готовить препараты из молодых агаровых культур (14-20-часового роста). В пробирки с культурой на скошенном агаре на 30-40 мин добавляют 0,5%-ный водный раствор пептона. Жидкость отстаивают, для осаждения перешедших в нее микробов, центрифугируют. Осадок заливают физиологическим раствором и центрифугируют повторно. С целью предотвращения потери жгутиков отмытый осадок ресуспензируют в 10%-ном растворе формалина для получения слегка мутной суспензии.

Окраска жгутиков осмиевой кислотой. На чистом обезжиренном предметном или часовом стекле смешивают каплю суспензии бактерий с каплей 2%-ного раствора осмиевой кислоты. Полученную каплю смеси тонким капилляром пастеровской пипетки наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Высушивают на воздухе и фиксируют на пламени (избегать перегревания!).

На фиксированный препарат наливают протраву, приготовленную за несколько суток (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 20%-ного водного раствора танина и 5,5 мл насыщенного водного раствора сернокислого аммиака железа). Через 15 мин протраву смывают водой, докрашивают 4 мин фуксином, промывают и микроскопируют.

Окраска жгутиков серебрением. Из суспензии готовят тонкий мазок, высушивают и фиксируют в течение 2-3 минут 2%-ным раствором осмиевой кислоты. Промывают препарат, погружением на 2-3 с в 0,5%-ный водный раствор азотнокислого серебра и, не промывая, опускают на 2-3 с в протраву (пирогаллол или галловая кислота - 2,0 г, танин – 1,2 г, натрий уксуснокислый – 4,0 г, вода дистиллированная - 150 мл). Вынимают из протравы и снова погружают в раствор азотнокислого серебра, выдерживая до тех пор, пока препарат не почернеет. После промывки проводят микроскопию.

Окраска жгутиков по Плиммеру. Готовят краску: танин - 5,0 г, цинк хлористый - 5,0 г, алюминий хлористый - 10,0 г, фуксин в порошке – 0,75 г навески перечисленных компонентов растирают в ступке, постепенно порциями добавляя 40 мл 60%-ного этанола до их полного растворения. Перед употреблением краску разводят водой (1:5).

На высушенный тонкий мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и заливают приготовленной краской. Через 2 мин краску смывают водой и дополнительно окрашивают карболовым фуксином Циля. Бактерии и жгутики - красного цвета.

Окраска жгутиков по Беничетти. Заранее готовят 3 раствора. Раствор 1: цинк сернокислый - 0,5 г, танин - 8,0 г, вода дистиллированная - 50 мл. Раствор 2: насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов. Раствор 3: насыщенный раствор генцианвиолета или кристаллвиолета. Перед употреблением растворы смешивают (5:5:3). На высушенный мазок наливают смесь растворов и нагревают до появления пара. Через 3 мин промывают и микроскопируют. Жгутики фиолетово-черного цвета.

Окраска по Валенти. Мазок обрабатывают 3 мин 20%-ным раствором танина при подогревании, промывают, окрашивают 10 мин карболовым фуксином при подогревании. Промывают, микроскопируют. Бактерии и жгутики - красного цвета.

Окраска по Грэю. Раствор А: дубильная 20%-ная водная кислота - 2 мл, насыщенный водный раствор калийных квасцов - 5 мл, хлористая ртуть, насыщенный водный раствор - 2 мл, основной фуксин 3%-ный в 96%-ном этаноле - 0,4 мл. Краситель (фуксин) добавляют к остальным ингредиентам непосредственно перед употреблением и после его растворения полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу. Раствор Б: карболовый фуксин Циля (основной фуксин 3%-ный на 95%-ном этаноле - 10 мл, фенол - 5 мл, дистиллированная вода - 95 мл).

Методика. Каплю бактерий (суспензию) в формалине наносят на стекло и дают ей стечь. Высушивают на воздухе. Кладут полоску фильтровальной бумаги и на 4-6 мин наливают раствор А. Промывают водой и 3 мин окрашивают через фильтровальную бумагу раствором Б. Промывают, высушивают, микроскопируют. Жгутики и бактерии - красного цвета.

Окраска по Ляйфсону. Готовят 3 раствора. Раствор 1: 1,5%-ный раствор хлористого натрия в дистиллированной воде. Раствор 2: 3%-ный раствор дубильной кислоты в дистиллированной воде. Раствор 3: уксуснокислый розанилин - 0,9 г, солянокислый прозанилин – 0,3 г, 96%-ный этанол - 100 мл. Смешивают поровну растворы 1 и 2 и затем 2 объема этой смеси приливают к 1 объему раствора 3. Смесь сохраняется в холодильнике до 3 месяцев.

Методика. Каплю суспензии наносят на хорошо обезжиренное стекло и дают ей стечь. Высушив, очерчивают карандашом по стеклу границы пленки бактерий, на 7-15 мин площадку заливают красителем. Выдерживают до тех пор, пока поверхность красителя приобретет золотистый цвет, а пленка бактерии не будет покрыта осадком. Промывают, высушивают. Бактерии и жгутики – красного цвета.

Методы окраски клеточной стенки

Окраска клеточной стенки имеет диагностическую ценность при дифференциации микоплазм от бактерий.

Метод Гутштейна. Препарат фиксируют 1-2 часа в жидкости Буэна, выдерживают 2-3 минуты в 5-10%-ном водном растворе танина, ополаскивают водой и микроскопируют в капле 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового.

Метод Пешкова. Препарат фиксируют 15 минут в жидкости следующего состава: этанол 90%-ный – 60 мл, хлороформ - 30 мл, уксусная эссенция – 10 мл. Далее препарат выдерживают в течение 2-5 минут в 10%-ном водном растворе танина, промывают водой, красят 30-60 секунд фуксином Пфейффера и, не перемешивая, подсушивают и микроскопируют.

Метод) Робиноу. Исследуемый микроорганизм выращивают на агаровой среде в чашке Петри, вырезают агаровый блок и кладут его поверхностью на покровное стекло, помещают на ночь в жидкость Буэна. На следующий день удаляют агар, стекло отпечатком вниз кладут на поверхность 5-10%-ното водного раствора таниновой кислоты на 20-30 минут. Затем препарат промывают водой, покровное стекло клетками бактерий вниз кладут на поверхность 0,02%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 5-10 секунд. В итоге клеточные оболочки и перегородки окрашиваются в темно-синий или в черный цвет, а цитоплазма остается неокрашенной.

Методы окраски цитоплазматических включений

При идентификации микроорганизмов определенное значение имеют данные о наличии в клетках включений, отражающих тип и направленность конструктивного метаболизма. К цитоплазматическим включениям относят поли-бетта-оксимасляную кислоту, зерна метахроматина (волютина) и полисахариды.

Поли-бетта-оксимасляная кислота представляет собой полиэфир бетта-оксимасляной кислоты, который накапливается в цитоплазме клеток в виде округлых или овальных гранул размером 200-800 нм. Метахроматин - это полифосфаты, а полисахариды – глюканы, состоящие из D-глюкозы, размером до 200 нм. Перечисденные включения выполняют роль своеобразных запасов веществ клеток и могут быть обнаружены специальными методами окраски.

Обнаружение поли-бетта-оксимасляной кислоты

Фиксированный над пламенем горелки мазок окрашивают 5-15 мин 0,3%-ным раствором Судана черного В в этиленгликоле. Краску сливают и после высушивания на воздухе без промывания водой ополаскивают в ксилоле. Дав мазку высохнуть, опускают на 5-10 с в 0,5%-ный водный раствор сафранина. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Включения поли-бетта-оксимасляной кислоты видны на розовом фоне цитоплазмы в виде черно-синих образований.

Обнаружение метахроматина (волютина)

Метод Нейссера. Готовят 4 раствора. Раствор А: метиленовый синий - 0,1 г, этанол 95%-ный - 2 мл, уксусная кислота ледяная - 6 мл, вода дистиллированная- 100 мл. Раствор Б: кристаллвиолет- 1 г, этанол 95%-ный - 100 мл, вода дистиллированная - 300 мл. Раствор В йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 2,0 г, вода дистиллированная - 300 мл. Раствор Г: хризоидин - 1 г, вода дистиллированная- 300 мл (хризоидин растворяют в горячей воде). На фиксированный над пламенем горелки мазок на 1 мин наливают смесь раствора А и Б в соотношении 2:1 (смесь готовят перед окраской). Сливают краску, обрабатывают 1 мин раствором В (раствор Люголя) и промывают водой, высушивают, микроскопируют. Клетки бактерий светло-желтого, зерна волютина - темно-синего цвета.

Метод Раскиной. Готовят краску следующего состава: карболовый фуксин Циля - 4 мл, насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини - 4 мл, кислота уксусная ледяная - 5 мл, этанол 96%-ный - 95 мл, вода дистиллированная -92 мл. На фиксированный над пламенем горелки мазок наливают краситель, нагревают над горелкой до сгорания спирта, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Клетки бактерий окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина - в черно-синий.

Обнаружение полисахаридов

Окраска реактивом Шиффа. Готовят 4 раствора. Раствор А (раствор периодата): 4%-ный раствор йодной кислоты - 20 мл, 0,2 М водный раствор ацетата натрия - 10 мл, 96%-ный этанол - 70 мл. Раствор чувствителен к свету, поэтому его следует хранить в темной склянке в темноте.

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) - сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных - от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий - периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами - β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом - антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У присутствует дополнительная структура - внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют - предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий - с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.

Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.

При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают. На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.

Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:

1. Грамположительные бактерии:

— кокки (за исключением гонококков и менингококков);

— бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);

— микобактерии, коринебактерии и листерии.

2. Грамотрицательные бактерии:

— некоторые кокки (гонококки и менингококки);

— все остальные палочковидные бактерии;

— все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Структура бактериальной клетки

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

— основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

— временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:

— защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

— определение формы бактерий;

— участие в метаболизме бактерий;

— токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);

— наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).

В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.

Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма ) представлен пептидогликаном в виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана ) состоит из липополисахарида , белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами . У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты — это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий — это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) — это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое ко-личество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

— барьерная функция (молекулярное “сито”);

— избирательный перенос раз-личных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

— превращение клеточ-ной энергии;

— репликация и последующее разделение хро-мосомы.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом . По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.

Цитоплазма — это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль — гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы — это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.

Рибосомы — органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.

В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включе-ния, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество — гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, назы-ваемых волютиновыми , или метахроматиновыми , зернами.

Нуклеоид является аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды , которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).

К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.

Капсула — это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.

Функции капсулы:

— место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;

— защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;

— способность прикрепления клеток к субстрату.

Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:

— монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;

— амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

— лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;

— перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином .

К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили . Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.

У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях — эндоспо-ры . Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.

Расположение спор в клетке:

— центральное (возбудитель сибирской язвы);

— субтерминальное — ближе к концу (возбудитель ботулизма);

— терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

Витальный способ окраски

Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры.

Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски

Способы окраски фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные . При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.
Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.
Из сложных способов окрашивания бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю - Нельсену, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю - Нельсону и др.

Для окраски простейших применяют способ Романовского - Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля - Нельсона, Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.

См. также

Литература

Барыкина Р.
П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с. - 2000 экз. - ISBN 5-211-06103-9. - УДК 58:57.08

Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю - Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение.

Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые).

Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток.

Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе.

Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Механизм и этапы окраски по Граму

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.

2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)

Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой

5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный.

Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону

На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин

2. Снять бумагу, провыть мазок водой

3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой

5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3-5 мин

Промыть водой, высушить и микроскопировать

* Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окр. метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.

Возбудитель чумы

Возбудитель – Yersinia pestis.

грамотрицательные палочки, овоидной формы, окрашиваются биполярно.

Подвижны, имеют капсулу, спор не образуют Факультативные анаэробы. Хорошо культивируются на простых питательных средах. Ферментируют большинство углеводов без образования газа. Два типа колоний — молодые и зрелые. Молодые с неровными краями. Зрелые колонии крупные, с бурым зернистым центром и неровными краями.

Биохимические свойства: фенментативная активнсть высокая: ферментация до кислоты ксилозу, синтез плазмокоагулазы, фибринолизина, гемолизина, лецитиназу, сероводород.

чувствителен к антибиотикам нестоек к окружающей среде при высокой температуре.

Клинические особенности: Инкубационный период – несколько часов до 8 сут. Различают локальные – кожно-бубонная, бубонная; внешне-диссеминированные – первично-легочная, вторично-легочная и кишечная; генерализованная – первично-септическая, вторично-септическая формы чумы. Региональная лимфоаденопатия, энтероколиты, реактивные артриты, спондилит, лихорадка.

Эпидемиология: Чума — классический природноочаговый зооноз диких животных.

Основные носители в природе — сурки, суслики, в городских условиях — крысы. В передаче возбудителя — блохи животных, способные заражать человека.

Иммунитет: клеточно-гуморальный, ограничен по длительности

Микробиологическая диагностика:

Бактериоскопическое исследование.

Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и водным раствором метиленового синего. Бактерии чумы представляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. На бульоне бактерии образуют пленку; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают.

Биопроба. Проводится для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой.

Экспресс-методы лабораторной диагностики:

2.РПГА — для обнаружения антигенов бактерий в материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.

Лечение: антибиотики Профилактика: специфическая профилактика — живая ослабленная чумная вакцина EV.

Чумной бактериофаг – при идентификации Y.pestis.

Чумная сухая вакцина – высушенная живая культура Y.pestis вакцинного штамма EV, используется для профилактики чумы.

Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.

Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).

Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/

Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.

В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы

Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.

Простые методы окраски

Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.

Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.

При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.

Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.

Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.

К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.

Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.

Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.

Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.

Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.

Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.

Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.

Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).

По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.

При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.

Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.

Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.

Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.

Сложные методы окраски

Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).

Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.

В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.

Среди сложных методов окраски большую ценность представляет способ окраски разработанный датским ученым Граммом, позволяющий дифференцировать микроорганизмы на две большие группы, называемые «грамположительными» и «грамотрицательными», что имеет большое значение при идентификации микроорганизмов.

Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.

Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных - он однослоен.

У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.

Микроорганизмы, которые сохраняют окраску, называются «грамположительными» и обозначаются «Г+», а обесцвеченные – «грамотрицательными» и обозначаются «Г-».

Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:

Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).

Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).

Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% - 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.

Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.

К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.

Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.

Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.

Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.

Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% - 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.

В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.

Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах, концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.

Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.

Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.

Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского

Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание пре-

паратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

При сложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus , Clostridium , Staphylococcus , Streptococcus , Lactobacillus , Sarcina , etc .) и грамотрицательные (Escherichia , Pseudomonas , Erwinia , Neisseria , Rickettsia , etc .) формы.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода . На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Этапы дифференцированного окрашивания по Граму:

Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.

Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.

Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.

Препарат быстро промывают водой (как описано выше).

Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).

Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

микроскопируют с иммерсионной системой.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.

Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий.

Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса . В основе метода лежит негативное контрастирование. Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка. По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO 4) 2 , HgCl 2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Вопросы для самоконтроля

1 Перечислите основные морфологические типы клеток микроорганизмов.

2 Охарактеризуйте схематичное строение бактериальной клетки.

3 Перечислите этапы приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, охарактеризуйте их.

5 Классифицируйте используемые в микробиологии красители, охарактеризуйте их.

Практическое занятие 4

Цель: ознакомление сметодикой приготовления фиксированных препаратов, простыми и сложными методами окраски; ознакомление с морфологией и цитологией различных микроорганизмов.

Материалы и оборудование: микроскопы биологические, предметные и покровные стекла, спиртовки, бактериальные петли, иммерсионное масло, стерильные пипетки, пинцеты, фильтровальная бумага, спички, палочки ватные гигиенические, маркеры, стерильные чашки Петри, на группу – в 50 мл колбе стерильная водопроводная вода, дистиллированная вода для промывки, промывалки, кюветы, мостики, набор готовых растворов красок в штативе, спирт 96 0 , пипетки, настои из естественных материалов: мяса, гороха и т.д.